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1. 자성 나노 입자 (MNP)의 결합
- 상용 커플링 절차 및 시약을 사용하여 MNP를 항체(Abs)(일반적으로 1mg)와 결합합니다. 반응기로 카르복실산을 갖는 산화철 나노 입자가 사용됩니다.
- 항체의 부피가 0.5ml보다 높으면 100K 농축기를 사용하여 농축하십시오. 2,000 x g에서 3-5분 동안 회전합니다.
- 절차가 끝나면 담금질 완충액 10μl를 첨가한 후 MNP를 12mm x 75mm 튜브로 옮기고 3ml 세척/보관 완충액을 추가합니다. 튜브를 자기 분리기의 중앙 구멍에 놓고 4°C에서 밤새 그대로 둡니다.
- MNP가 모두 튜브 측면에 모였는지 확인한 다음 모든 액체를 조심스럽게 피펫으로 빼냅니다. 새 세척/보관 버퍼 3ml를 넣고 자석에 다시 넣습니다.
- 몇 시간 후 MNP가 튜브 측면에 모였는지 확인한 다음 액체를 피펫으로 제거합니다. 2ml의 세척/보관 버퍼를 사용하여 MNP를 재현탁하고 4°C에서 보관합니다.
- 관련 형광 Fab 항체 단편(예: 섹션 2에 설명된 대로 포획을 위해 마우스 단클론 Ab를 사용하는 경우 염소 안티 마우스)으로 라벨링하고 유세포 분석기에서 실행하여 Abs가 MNP와 결합되어 있는지 확인합니다.
2. MNP에 결합된 항체 라벨링
- 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에서 포획 Ab의 isotype에 특이적인 60 μl(3.9 x 1012 입자)의 MNP(조건당)와 5 μl(200 μg/ml 상용 용액)로 표지된 Fab 단편을 결합합니다.
- 실온(RT)에서 연속 혼합으로 30분 동안 배양합니다.
- 100K 농축기에 300μl의 인산염 완충 식염수(PBS)를 미리 적시고 1,500 x g의 마이크로 원심분리기에서 5분 동안 회전시킵니다.
- 100K 컬럼에서 라벨링된 복합체를 정제합니다. 1,500 x g의 마이크로 원심분리기에서 2.2단계의 혼합물을 5분 동안 회전시키고 200μl PBS로 세척한 다음 초기 부피에서 회복합니다.
3. 관심 입자(세포외 소포체, EV)를 포착하기 위해 라벨링된 Ab-MNP 복합체의 사용
- 사전 라벨링된 MNP 60 μl(3.9 x 1012 입자)를 EV 준비(100 μl)로 배양합니다.
- 다양한 방법을 사용하여 EV 준비를 준비합니다. 여기에서 자당 구배에서 EV를 정제하고, 엑소좀 침전 시약을 사용하여 혈소판이 부족한 혈장에서 EV를 수집하거나 혈장에서 직접 분리합니다.
메모: 각 실험에 대해 최적의 비율을 결정해야 하며 이는 제제 내 EV 농도에 따라 달라집니다. MNP-Ab 분획은 EV 분획의 농도에 비해 ~106 초과해야 합니다.
- EV의 경우 4°C에서 1시간 배양합니다.
- 2.5% 마우스 IgG/인간 IgG를 추가하여 Fc 결합을 차단하고 부드럽게 와류를 일으키며 RT에서 3-5분 동안 배양합니다.
- 각 검출 Abs의 제조업체 권장 농도 또는 역가 농도를 추가하고 RT에서 추가로 20분 동안 배양합니다.
4. 마그네틱 컬럼을 사용하여 MNP 캡처 EV와 Unbound 항체 분리
- 사용할 자기 분리 컬럼을 분리막 자석에 넣어 준비합니다.
- 500μl의 세척 버퍼(2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), PBS 내 0.5% 소 혈청 알부민(BSA))으로 컬럼을 미리 적십니다. 세척 버퍼가 컬럼을 통해 흐르도록 합니다.
- 컬럼에 MNP-EV 복합체를 추가하고 모든 액체가 통과하도록 합니다. 컬럼에 500μl의 세척 버퍼를 추가하여 전체 부피가 통과할 수 있도록 합니다.
- 세탁 버퍼로 세탁을 2회 더 반복합니다.
- 자석에서 컬럼을 제거하고 12mm x 75mm 튜브에 넣어 잔류된 MNP-EV 복합체를 수집합니다. 컬럼을 자석에서 떨어진 튜브에 3분 동안 그대로 두십시오. PBS 200μl를 추가하고 비드가 중력에 의해 아래로 흐르도록 하고 PBS 200μl를 더 첨가한 다음 용출 후 200μl 4% 파라포름알데히드로 고정합니다.
메모: 파라포름알데히드는 발암물질로 의심되는 물질이므로 통풍이 잘 되는 후드에서 취급해야 하며 장갑을 착용해야 합니다.
- 단일 EV를 정량화하려면 HTS(High Throughput Sampler)에서 체적 설정을 사용하거나 획득 직전에 잘 혼합된 유세포 분석 카운트 비드를 추가합니다.
5. 유세포분석기를 사용한 MNP 캡처 EV 분석
- 유세포 분석기를 30분 동안 예열합니다.
- 품질 관리 비드를 실행합니다.
- MNP 또는 라벨링된 EV의 형광에 대한 임계값을 설정합니다. 임계값으로 0.22μm 필터링된 PBS를 사용하여 배경 "노이즈"를 줄입니다. 필터링된 PBS가 이벤트를 제공하지 않거나 매우 적은 수준에서 PMT 전압을 조정하여 임계값을 설정합니다.
- 샘플을 낮은 온도에서 실행합니다. (잘못된 이벤트를 추가로 제거하려면 표준 0.2μm 시스 필터 뒤에 직렬로 배치된 시스 유체에 대해 추가 0.04μm 인라인 필터를 사용하십시오.)