항원 특성 분석을 위한 세포외 소포체의 면역포획 및 유세포 분석(Immunocapture and flow cytometry of Extracellular Vesicles for Antigenic Characterization)

초록

출처: Arakelyan, A. et al., Virion 및 Extracellular Vesicles의 항원 스펙트럼을 분석하기 위한 유동 Virometry.J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 형광 표지 포획 항체-자기 나노입자 접합체를 사용하여 세포외 소포체의 면역 캡처를 보여줍니다. 이 프로세스에는 복잡한 형성, 형광 표지된 검출 항체를 사용한 염색, 자기 분리 및 항원 특성 분석을 위한 유세포 분석이 포함됩니다.

프로토콜

1. 자성 나노 입자 (MNP)의 결합

1. 상용 커플링 절차 및 시약을 사용하여 MNP를 항체(Abs)(일반적으로 1mg)와 결합합니다. 반응기로 카르복실산을 갖는 산화철 나노 입자가 사용됩니다.
   1. 항체의 부피가 0.5ml보다 높으면 100K 농축기를 사용하여 농축하십시오. 2,000 x g에서 3-5분 동안 회전합니다.
2. 절차가 끝나면 담금질 완충액 10μl를 첨가한 후 MNP를 12mm x 75mm 튜브로 옮기고 3ml 세척/보관 완충액을 추가합니다. 튜브를 자기 분리기의 중앙 구멍에 놓고 4°C에서 밤새 그대로 둡니다.
3. MNP가 모두 튜브 측면에 모였는지 확인한 다음 모든 액체를 조심스럽게 피펫으로 빼냅니다. 새 세척/보관 버퍼 3ml를 넣고 자석에 다시 넣습니다.
4. 몇 시간 후 MNP가 튜브 측면에 모였는지 확인한 다음 액체를 피펫으로 제거합니다. 2ml의 세척/보관 버퍼를 사용하여 MNP를 재현탁하고 4°C에서 보관합니다.
5. 관련 형광 Fab 항체 단편(예: 섹션 2에 설명된 대로 포획을 위해 마우스 단클론 Ab를 사용하는 경우 염소 안티 마우스)으로 라벨링하고 유세포 분석기에서 실행하여 Abs가 MNP와 결합되어 있는지 확인합니다.

2. MNP에 결합된 항체 라벨링

1. 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에서 포획 Ab의 isotype에 특이적인 60 μl(3.9 x 10¹² 입자)의 MNP(조건당)와 5 μl(200 μg/ml 상용 용액)로 표지된 Fab 단편을 결합합니다.
2. 실온(RT)에서 연속 혼합으로 30분 동안 배양합니다.
3. 100K 농축기에 300μl의 인산염 완충 식염수(PBS)를 미리 적시고 1,500 x g의 마이크로 원심분리기에서 5분 동안 회전시킵니다.
4. 100K 컬럼에서 라벨링된 복합체를 정제합니다. 1,500 x g의 마이크로 원심분리기에서 2.2단계의 혼합물을 5분 동안 회전시키고 200μl PBS로 세척한 다음 초기 부피에서 회복합니다.

3. 관심 입자(세포외 소포체, EV)를 포착하기 위해 라벨링된 Ab-MNP 복합체의 사용

1. 사전 라벨링된 MNP 60 μl(3.9 x 10¹² 입자)를 EV 준비(100 μl)로 배양합니다.
   1. 다양한 방법을 사용하여 EV 준비를 준비합니다. 여기에서 자당 구배에서 EV를 정제하고, 엑소좀 침전 시약을 사용하여 혈소판이 부족한 혈장에서 EV를 수집하거나 혈장에서 직접 분리합니다.
      메모: 각 실험에 대해 최적의 비율을 결정해야 하며 이는 제제 내 EV 농도에 따라 달라집니다. MNP-Ab 분획은 EV 분획의 농도에 비해 ~10⁶ 초과해야 합니다.
2. EV의 경우 4°C에서 1시간 배양합니다.
3. 2.5% 마우스 IgG/인간 IgG를 추가하여 Fc 결합을 차단하고 부드럽게 와류를 일으키며 RT에서 3-5분 동안 배양합니다.
4. 각 검출 Abs의 제조업체 권장 농도 또는 역가 농도를 추가하고 RT에서 추가로 20분 동안 배양합니다.

4. 마그네틱 컬럼을 사용하여 MNP 캡처 EV와 Unbound 항체 분리

1. 사용할 자기 분리 컬럼을 분리막 자석에 넣어 준비합니다.
2. 500μl의 세척 버퍼(2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), PBS 내 0.5% 소 혈청 알부민(BSA))으로 컬럼을 미리 적십니다. 세척 버퍼가 컬럼을 통해 흐르도록 합니다.
3. 컬럼에 MNP-EV 복합체를 추가하고 모든 액체가 통과하도록 합니다. 컬럼에 500μl의 세척 버퍼를 추가하여 전체 부피가 통과할 수 있도록 합니다.
4. 세탁 버퍼로 세탁을 2회 더 반복합니다.
5. 자석에서 컬럼을 제거하고 12mm x 75mm 튜브에 넣어 잔류된 MNP-EV 복합체를 수집합니다. 컬럼을 자석에서 떨어진 튜브에 3분 동안 그대로 두십시오. PBS 200μl를 추가하고 비드가 중력에 의해 아래로 흐르도록 하고 PBS 200μl를 더 첨가한 다음 용출 후 200μl 4% 파라포름알데히드로 고정합니다.
   메모: 파라포름알데히드는 발암물질로 의심되는 물질이므로 통풍이 잘 되는 후드에서 취급해야 하며 장갑을 착용해야 합니다.
6. 단일 EV를 정량화하려면 HTS(High Throughput Sampler)에서 체적 설정을 사용하거나 획득 직전에 잘 혼합된 유세포 분석 카운트 비드를 추가합니다.

5. 유세포분석기를 사용한 MNP 캡처 EV 분석

1. 유세포 분석기를 30분 동안 예열합니다.
2. 품질 관리 비드를 실행합니다.
3. MNP 또는 라벨링된 EV의 형광에 대한 임계값을 설정합니다. 임계값으로 0.22μm 필터링된 PBS를 사용하여 배경 "노이즈"를 줄입니다. 필터링된 PBS가 이벤트를 제공하지 않거나 매우 적은 수준에서 PMT 전압을 조정하여 임계값을 설정합니다.
4. 샘플을 낮은 온도에서 실행합니다. (잘못된 이벤트를 추가로 제거하려면 표준 0.2μm 시스 필터 뒤에 직렬로 배치된 시스 유체에 대해 추가 0.04μm 인라인 필터를 사용하십시오.)

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자료
카르복실 자성 산화철 나노 입자 접합 키트	오션 나노텍	ICK-15-005
Amicon Ultra-4 원심 필터 장치(Ultracel-100 멤브레인 포함	밀리포어	UFC810024
5mL 둥근 바닥 PP 시험관, 캡 없음	송골매	352002
DEPC 처리수	고품질 생물학	Tel.: 351-068-131
SuperMAG-01 자기 분리기	오션 나노텍	슈퍼MAG-01
zenon R-Phycoerythrin 마우스 IgG1 라벨링 키트	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Z25055
Nanosep Omega 멤브레인 100k가 있는 원심 장치	폴 코프	OD100C34
EDTA 0.5엠	코닝 Cellgro	46-034-CI
소 세럼 알부민 솔루션	시그마-알드리치	A9576-50ML
PBS (PBS)	지브코	10010-23
파라포름알데히드, EM 등급, 정제	EMS (엠에스)	15710
123count e비즈	이바이오사이언스	01-1234-42
CytoCount 비드	다코	S2366
AccuCheck 카운트 비드	인비트로젠	PCB100
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) (사이토미터 설정 및 추적 비드 키트)	BD 생명과학	642412
설비
μMACS 컬럼	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-701
OctoMACS 분리기 자석	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-108
나노드롭	써모피셔	없음
나노사이트 NS300	맬 버 른	없음
BD LSRII 유세포 분석기	BD 생명과학	없음
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