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1. 생물학적 시료 준비
참고: 선택한 해부학적 부위와 채혈량은 각 개별 조사자의 재량에 맡겨지며 분석 결과에 영향을 미치지 않습니다. 그러나 일단 샘플을 얻은 후에는 아래 나열된 단계에 따라 샘플을 처리해야 합니다.
- 혈청 샘플의 준비
- 원하는 양의 혈액을 선호하는 채취 튜브에 모으고 최소 30분 동안 응고시킵니다.
- 실온에서 1,000 x g에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다.
- 혈청과 분석을 즉시 제거하거나 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브에 분취하고 ≤ -20°C에서 검체를 보관하십시오.
- 혈장 시료 준비
- 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 코팅된 채혈 튜브를 사용하여 원하는 양의 혈액을 수집합니다.
- 1,000 x g에서 10분, 실온에서 채취 후 30분 이내에 원심분리기.
- 혈장과 분석을 즉시 제거하거나 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브에 분취하고 ≤ -20°C에서 샘플을 보관하십시오.
- 조직 배양 상등액 시료의 준비
- 4°C에서 1,500 x g에서 10분 동안 샘플을 원심분리하여 세포와 파편을 제거합니다.
- 상층액과 분석액을 즉시 수집하거나 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브에 분취하여 ≤-20°C에서 보관하십시오.
- 동결된 생물학적 샘플의 해동
- 이전에 얼어붙은 생물학적 샘플을 사용하기 전에 얼음과 소용돌이에서 잠시 동안 완전히 해동하십시오. 2회 이상의 동결/해동 주기를 피하십시오.
메모: 이 프로토콜에 사용된 샘플은 BALB/c 마우스 비장세포(37°C + 5%CO2에서 1 x 106개 세포)를 자극되지 않은 LPS(100ng/mL), αCD3(1μg/mL 플레이트 코팅) + αCD28(1μg/mL 용해성), PMA(20ng/mL) + 이오노마이신(500ng/mL)의 다양한 조건에서 배양하여 얻었습니다. 배양 상등액을 48시간 후에 수거하여 섹션 1.3에 기재된 바와 같이 처리하였다.
2. 시약 준비
- Pre-mixed Antibody-Immobilized Beads의 준비
- 미리 혼합된 구슬 병을 실온의 초음파 발생기 수조에서 1분 동안 초음파 처리한 다음 사용하기 전에 30초 동안 소닉처리합니다. 초음파 세척기를 사용할 수 없는 경우 소용돌이 시간을 1분으로 늘립니다.
- 세척 버퍼의 준비
- 키트와 함께 제공된 20x Wash Buffer(20x PBS 및 1% Tween-20)를 실온과 와류로 가져와 모든 염을 용액으로 가져옵니다.
- 25mL의 20x Wash Buffer를 475mL의 탈이온수로 희석합니다. 사용하지 않은 부분은 2 °C에서 8 °C 사이에서 최대 한 달 동안 보관하십시오.
- 매트릭스 B의 준비(혈청 및 혈장 샘플에만 사용)
- 키트에 포함된 분석 완충액 5.0mL(BSA 1% PBS)를 동결건조된 매트릭스 B가 들어 있는 병에 추가합니다. 완전한 재구성을 위해 최소 15분을 기다린 다음 와류가 잘 혼합되도록 합니다. 남은 재구성 매트릭스 B는 최대 한 달 동안 ≤ -70 °C에서 보관할 수 있습니다.
3. 표준 준비
참고: 이 패널의 각 분석물의 최고 표준 농도는 10,000pg/mL입니다.
- 250 μL의 Assay Buffer를 추가하여 동결건조된 Mouse Th Cytokine Standard Cocktail을 재구성합니다. 간단히 와류로 혼합하고 바이알을 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다.
- 표준 칵테일을 "C7"이라고 표시된 폴리프로필렌 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이것은 최고 표준으로 사용됩니다.
- 6개의 폴리프로필렌 미세 원심분리기 튜브를 C6, C5, C4, C3, C2 및 C1로 표시합니다.
- 이러한 각 튜브에 75μL의 분석 버퍼를 추가합니다.
- 최고 표준물질 C7 25 μL를 C6 튜브로 옮기고 볼텍싱으로 잘 혼합합니다. 이것이 C6 표준이 될 것입니다.
- 각 튜브에 대해 새로운 피펫 팁을 사용하여 다음으로 가장 낮은 표준물질 튜브에 있는 75μL의 분석 버퍼에 이전 표준물질 25μL를 추가한 다음 볼텍싱을 수행하여 표준 C5, C4, C3, C2 및 C1을 획득하여 직렬 1:4 희석을 계속 수행합니다. 분석 버퍼를 0pg/mL 표준물질(C0)로 사용합니다.
4. 시료 희석
참고: 특정 생물학적 시료 세트에 가장 적합한 희석 계수를 결정하기 위해 여러 희석액과 함께 이 분석을 사용하는 예비 파일럿 실험이 필요할 수 있습니다. 적절한 희석 계수는 표준 곡선의 한계 내에 있는 샘플에 대한 농도 계산을 생성합니다. 다음 단계는 지침으로 사용되며 샘플 유형에 따라 경험적으로 결정해야 할 수 있습니다.
- 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브에서 분석 버퍼로 혈청 또는 혈장 샘플을 2배 희석합니다(예: 50μL의 샘플을 50μL의 분석 버퍼로 희석).
메모: 추가 시료 희석이 필요한 경우, 정확한 측정을 보장하기 위해 분석 버퍼 대신 Matrix B로 희석해야 합니다. 희석 없이 혈청 또는 혈장 샘플을 추가하면 분석 정확도가 낮아지고 필터 플레이트가 막힐 수 있습니다. 매트릭스 B는 내인성 분석 표적이 고갈된 풀링된 마우스 혈청으로 구성됩니다. 면역 분석의 분석 감도에 영향을 미치는 것으로 알려진 매트릭스 효과를 피하기 위해 혈청 또는 혈장 샘플 희석제로 사용됩니다.
- 희석 없이 세포 배양 상등액 샘플을 테스트합니다.
메모: 분석물의 수준은 샘플마다 크게 다를 수 있습니다. 필요한 경우, 상층액 시료를 해당 세포 배양 배지 또는 분석 완충액의 새로운 제제를 사용하여 희석합니다.
5. 분석 절차
참고: 이 분석은 폴리프로필렌 필터 플레이트, 마이크로 형광 활성화 세포 분류(FACS) 튜브 또는 V-바닥 마이크로플레이트에서 수행할 수 있습니다. 필터 플레이트 분석 절차는 우수한 시료 간 일관성, 분석 견고성 및 취급 용이성으로 인해 권장됩니다. 이 절차에는 세척을 위한 진공 여과 장치(최종 사용자가 제공)가 필요합니다.
- 사용하기 전에 모든 시약을 실온(20 - 25 °C)으로 데우십시오.
- 분석 설정 및 배양 단계 중에 항상 거꾸로 된 플레이트 덮개에 필터 플레이트를 설정하여 누출을 유발할 수 있으므로 플레이트 바닥이 표면에 닿지 않도록 합니다.
- 비드 손실을 방지하기 위해 세척 단계를 포함한 전체 분석 절차 동안 플레이트를 똑바로 세우십시오.
- 모든 배양 단계를 위해 플레이트를 어두운 곳에 보관하거나 알루미늄 호일로 감싸십시오.
- 모든 표준물질과 샘플을 순차적으로 플레이트에 정렬된 복제본으로 실행합니다.
- 각 웰에 100μL의 1x Wash Buffer를 추가하여 필터 플레이트를 미리 적시고 실온에서 1분 동안 그대로 둡니다(필터 하단 마이크로플레이트를 사용하는 경우).
- 진공 매니폴드를 사용하여 버퍼 부피를 제거합니다(5 - 10 s). 진공의 10 " Hg를 초과하지 마십시오. 깨끗한 종이 타월 더미에 접시를 눌러 접시 바닥에서 여분의 세탁 버퍼를 닦아냅니다. 거꾸로 된 플레이트 덮개 위에 플레이트를 놓습니다.
메모: V-bottom microplate 또는 micro FACS 튜브를 사용하여 분석을 수행하는 경우 5.1 - 5.2단계를 생략할 수 있습니다.
- 세포 배양 상등액 샘플의 경우 모든 웰에 25μL의 Assay Buffer를 추가합니다. 각 표준물질 25μL를 표준물질 웰에 추가합니다. 각 샘플 25μL를 샘플 웰에 추가합니다.
- 혈청 또는 혈장 샘플을 측정하기 위해 25μL의 Matrix B를 표준 웰에 추가합니다. 25μL의 분석 버퍼를 샘플 웰에 추가합니다. 각 표준물질 25μL를 표준물질 웰에 추가합니다. 각 희석된 혈청 또는 혈장 시료 25μL를 시료 웰에 추가합니다.
- Vortex 혼합 비드를 30초 동안 사용합니다. 각 웰에 25μL의 혼합 비드를 추가하고 비드 침전을 방지하기 위해 비드 병을 간헐적으로 흔듭니다. 최종 부피는 비드 첨가 후 각 웰에서 75μL여야 합니다.
- 플레이트 씰러로 플레이트를 밀봉하십시오. 거꾸로 된 판 덮개를 포함한 전체 판을 알루미늄 호일로 감쌉니다. 접시 셰이커에 접시를 놓고 고정한 다음 실온에서 500시간 동안 약 2rpm으로 흔듭니다. 누출을 방지하려면 플레이트 실러에 양압을 가하지 마십시오.
- 반전하지 않고 플레이트를 진공 매니폴드에 놓고 이전과 같이 진공을 적용하고 각 웰에 200μL의 1x 세척 버퍼를 추가합니다.
- 진공 여과로 분석 플레이트 웰의 내용물을 제거합니다. 접시 바닥의 과도한 세탁 버퍼를 흡수 패드나 종이 타월로 닦아냅니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
메모: V-bottom microplate 또는 micro FACS 튜브를 사용하여 분석을 수행하는 경우 1.12 및 1.13 단계를 건너뜁니다. 대신 실온에서 1,000 x g의 플레이트를 5분 동안 원심분리한 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.
- 각 웰에 25μL의 검출 항체(재료 표 참조)를 추가합니다.
- 새 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉하십시오. 거꾸로 된 판 덮개를 포함한 전체 판을 알루미늄 호일로 감쌉니다.
- 플레이트 셰이커에 플레이트를 놓고 실온에서 500시간 동안 약 1rpm으로 흔듭니다.
- 진공 청소하지 않고 25μL의 스트렙타비딘-피코에리트린(SA-PE) 시약을 각 웰에 직접 첨가합니다. 시약을 희석할 필요가 없습니다.
- 새 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉하십시오. 거꾸로 된 판 덮개를 포함한 전체 판을 알루미늄 호일로 감쌉니다.
- 플레이트 셰이커에 플레이트를 놓고 실온에서 500분 동안 약 30rpm으로 흔듭니다.
- 위의 1.13단계를 반복합니다.
- 각 웰에 200μL의 1x 세척 버퍼를 추가합니다. 플레이트 셰이커에 구슬을 1분 동안 다시 매달아 놓습니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 필터 플레이트에서 FACS 튜브로 샘플을 전송하여 유세포 분석기에서 샘플을 판독합니다.
메모: 샘플이 건조되는 것을 방지하기 위해 각 튜브에 100μL의 1x Wash Buffer를 추가하여 샘플 부피를 200μL에서 300μL로 늘릴 수 있습니다. 필요한 경우 샘플을 4°C에서 보관하고 빛으로부터 보호한 다음 다음 날 분석할 수 있습니다. 그러나 샘플을 장기간 보관하면 신호가 감소할 수 있습니다.