면역조직화학을 이용한 뇌 조직에서 비정상적인 프리온 단백질 검출

Abstract

출처: Orge, L., et al. 면역조직화학에 의한 비정상 프리온 단백질 검출. J. Vis. 특급 (2023).

이 비디오는 면역조직화학을 사용하여 뇌 절편에서 잘못 접힌 프리온 단백질을 검출하는 기술을 보여줍니다. 포름산으로 뇌 절편을 처리하여 프리온을 변성시키고 감염 위험을 최소화하고, 열 유도 항원결정기 회수를 사용하여 프리온 응집체의 가면을 벗기면 잘못 접힌 프리온 단백질 응집체에 대한 절편을 면역 표지하고 현미경으로 관찰합니다.

Protocol

1. 조직 절편 및 슬라이드 준비

1. 마이크로톰을 사용하여 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 조직의 단면을 3-5μm 두께로 절단합니다.
2. 사용된 파라핀의 녹는점보다 약 10°C 낮은 온도의 정제수에 섹션을 띄웁니다. 물에서 섹션을 들어 특수 처리된 현미경 슬라이드로 이동합니다(재료 표 참조). 슬라이드에서 물이 완전히 배수되도록 합니다.
3. 조직의 슬라이드 접착력을 향상시키기 위해 50 °C에서 밤새 슬라이드를 배양하십시오 .
   메모: TSE 양성 및 음성 대조군 절편을 미리 준비하여 보관할 수 있지만 IHC 프로토콜에 대해 새로 절편화된 조직을 준비하는 것이 바람직합니다. 2-4단계는 화학 흄 후드에서 수행해야 합니다.

2. 탈파라핀화와 재수화

1. 조직 섹션이 있는 슬라이드를 스테인리스 스틸 염색 바구니에 넣습니다(재료 표 참조). 바구니를 자일렌 수조(스테인리스 스틸 염색 용기)에 3분 동안 담갔다가 꺼냈다가 다시 한 번 담급니다.
2. 자일렌을 제거하고 절대적인 에탄올 욕조에 3분 동안 담궈 부분을 재수화한 다음 제거하고 다시 한 번 담급니다.
3. 섹션을 자연 건조하고 90% 에탄올 수조에 1분 동안 넣고 70% 에탄올 수조로 1분 더 옮긴 다음 50% 에탄올 수조로 1분 동안 마지막으로 옮깁니다. 각 에탄올 수조 처리에 대해 슬라이드 바스켓을 두 번 부드럽게 저어주고 다음 옮기기 전에 바스켓을 배수하십시오.

3. 에피토프 회수

1. 조직 절편을 실온에서 30분 동안 98% 포름산에 조심스럽게 담그고 단면을 수돗물로 5분 동안 헹군 다음 증류수로 두 번 헹굽니다.
   주의: 포름산은 부식성이 강합니다. 보호용 고글과 장갑을 착용해야 합니다.
2. 아래 단계에 따라 HIER(열 유도 항원 검색)을 수행합니다.
   메모: 이 단계는 특정 압력 챔버에서 121°C에서 30분 동안 수화된 오토클레이빙으로 수행됩니다(재료 표 참조).
   1. 500mL의 증류수로 채워진 압력 챔버 내부에 놓인 스테인리스강 염색 용기에 시트레이트 완충액(10mM, pH 6.1, 재료 표 참조)을 98°C에서 약 20분 동안 예열합니다.
      메모: 본 연구에서 프로그램 Set Point는 사용된 특정 장비에 대해 1(SP1)이었습니다.
   2. 알람이 장비가 프로그래밍된 시간과 온도에 도달했음을 나타내면 바구니에 슬라이드를 담그고 프로그램을 설정값 2(121분 동안 30°C)로 시작합니다. 품질 관리를 위해 바스켓에 접착 오토클레이브 표시기 테이프 섹션을 배치하여 온도와 압력을 모니터링하고 이 프로그램의 초기 및 최종 압력을 기록합니다.
   3. 면역 염색할 슬라이드의 수가 바스켓의 용량에 도달하지 않으면 깨끗하고 빈 슬라이드를 사용하여 빈 위치를 차지하십시오. 프로그램이 종료된 후 챔버가 주변 압력(최소 30분)으로 수동 복귀하도록 허용합니다.
      메모: 지속 시간이 길수록 비특이적 배경 염색을 줄일 수 있습니다.
   4. 슬라이드 바스켓을 증류수를 채운 스테인리스 스틸 염색 용기에 5분 동안 조심스럽게 옮깁니다.

4. 내인성 과산화효소의 불활성화

1. 샘플 섹션이 포함된 슬라이드 바구니를 메탄올에 3% 과산화수소(H₂O₂)가 담긴 수조에 30분 동안 담그고 섹션을 흐르는 물(5분)로 헹굽니다. 섹션을 배수하고 1x Tris-buffered saline(TBS)에 5분 더 담급니다.

5. 면역 검출

참고: 본 연구에서 면역검출은 상업적으로 이용 가능한 슬라이드 클립 어셈블리 시스템을 사용하여 모세관 갭 형식을 사용하여 실행되었습니다(재료 표 참조). 다른 면역조직화학 슬라이드 시스템도 적용할 수 있습니다.

1. 기포를 피하고 티슈 면이 홀더를 향하고 슬라이드 가장자리가 홀더의 두 하단 지점과 일치하도록 TBS가 미리 적신 시중에서 판매되는 덮개 플레이트 홀더(재료 표 참조)에 각 슬라이드를 놓습니다.
   1. 엄지 손가락과 집게 손가락 사이에 슬라이드 홀더 어셈블리를 잡고 한 손가락은 샘플 슬라이드 위에, 다른 손가락은 홀더 하단에 놓습니다. 그런 다음 어셈블리를 시스템의 갤러리에 배치합니다.
   2. 세트가 잘 조립되었는지 확인하려면 샘플 슬라이드와 홀더 사이의 웰을 TBS로 채우십시오. 이는 즉시 넘쳐나지 않아야 합니다. 이 시점부터 홀더와 슬라이드 사이에 약 80μL의 TBS가 유지되어야 합니다. 섹션이 건조되지 않도록 하십시오.
2. 시스템에 들어가면 1차 항체(프리온 단백질에 대한 항체(anti-PrP), 재료 표 참조)로 처리하기 전에 배경 염색을 줄이기 위해 TBS에서 30분 동안 면역 염색에 사용되는 2차 항체 숙주(본 사례, 말 혈청)와 동일한 종의 20% 정상 혈청으로 샘플 슬라이드를 사전 배양합니다.
3. 분석 대상 동물 종에 따라 사용할 항체의 부분 표본 수, 검사할 샘플 절편 수 및 작업 희석량의 양을 해동합니다.
   메모: 최상의 결과를 얻으려면 2차 항체 및 1차 항체 용액의 공급원과 동일한 종의 일반 혈청 10%를 사용하십시오. 가능하다면, 최상의 결과를 위해 정상 혈청과 2차 항체의 숙주 공급원은 동일한 종에서 유래해야 합니다.
4. 섹션을 세척하지 않고 슬라이드 홀더 세트의 각 웰에 기본 항체 용액을 직접(200μL) 바르고 실온에서 60분 동안 배양합니다.
5. 세탁을 위해 슬라이드 홀더 세트의 웰에 TBS를 채우고 5분 동안 기다립니다. 두 번 반복합니다.
6. 비오틴화된 2차 항체(단클론 항 쥐 Horse Ab, 재료 표 참조)를 TBS의 1/200에서 10% 말 혈청으로 희석합니다. 처리할 절편의 수에 따라 필요한 부피를 준비합니다.
7. 2차 항체 용액(200μL)을 슬라이드 홀더 세트의 각 웰에 적용합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
8. 5.5단계에 설명된 대로 세척합니다.
9. avidin-biotin complex peroxidase (ABC/HRP complex, Table of Materials(재료표 참조)를 사용한 배양의 경우, 사용 30분 전에 시약을 준비합니다. ABC/HRP 복합 용액(200μL)을 슬라이드 플레이트 홀더 세트의 각 웰에 적용합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
10. 5.5단계에 설명된 대로 세척합니다.

6. 3,3' 디아미노벤지딘(DAB) 발색체 개발

주의: DAB는 잠재적인 발암 물질입니다. 결과적으로 이 시약으로 작업하는 동안 눈 보호, 실험복, 장갑 및 우수한 실험실 절차를 포함하여 적절한 관리가 필요합니다. 현지 규정에 따라 폐기하십시오.

1. 사용하기 직전에 제조업체의 지침(재료 표 참조)에 따라 발색량을 희석하십시오. 발색 용액(400μL)을 슬라이드 플레이트 세트의 각 웰에 도포합니다.
2. 실온에서 최대 30분 동안 배양합니다. PrP^Sc(프리온 단백질의 비정상 동형) 양성 절편에서는 일반적으로 10분의 배양 기간으로 충분합니다.
3. 증류수로 슬라이드를 세척하여 잔류 발색 용액을 제거합니다. 덮개판 홀더에서 슬라이드를 제거하고 증류수가 담긴 플라스틱 용기에 넣습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
앱솔루트 에탄올	랩켐	LB0507-9010	원액화되지 않음
			증류수에 90%, 70%, 50%를 희석했습니다.
Avidin-비오틴 복합체 및 peroxidase 벡타스테인 엘리트 ABC 키트 퍼록시다제	벡터 연구소	PK-6100	키트 지침에 따라 사용하기 30분 전에 준비하고 부드럽게 섞으십시오. 서 있는 후에는 섞지 마십시오.
비오틴화 2차 항체 (Horse anti-mouse IgG H+L)	벡터 연구소	학사 - 2000-1.5	TBS에서 1/200으로 10% 말 일반 세럼으로 희석합니다. 섹션 수에 따라 필요한 볼륨을 준비합니다.
크로모겐 디아미노벤지딘- DAB, 기질 키트, 과산화효소	벡터 연구소	SK-4100	키트 지침에 따라 사용하기 전에 준비하십시오. 섹션당 400μL의 용액을 사용합니다.
DakoCytomation 파스칼 압력 챔버	다코	S2800
에를리히의 헤마톡실린:
앱솔루트 에탄올	랩켐	LB0507-9010
빙초산	머 크	101830
칼륨 명반	머 크	1.01047.1000
글리세린	머 크	1.04091.1000
내인성 과산화효소 블록 용액(3% 농도 H2O2			360mL 메탄올 중 40mL 과산화수소(30% w/w). 사용 전 준비
과산화수소 (30% w/w)	샬라우	하이0136
메탄올	시그마 알드리치	322415-2L
포름산 98%	머 크	1.00264.1000	원액화되지 않음
마이크로톰	샨돈-AS325	마이크로톰	샨돈-AS325
TBS의 일반 세럼 (20 %) 블록 용액 : 호스 노멀 세럼	지브코	16050-122	분석의 절편 수에 따라 최종 부피를 준비합니다 (단면 당 200 μL의 용액).
1차 항체 항-PrP 마우스 MAb 2G11	바이오라드	MCA2460	PRP 146-R154R171182 비정형 스크래피, 자궁경부, 고양이를 포함한 난소. bovine. 에 적합하지 않습니다. 분석의 절편 수(단면당 용액 200μL)와 항체 희석에 따라 2차 항체가 형성된 종의 정상 혈청 10%가 보충된 TBS에서 최종 부피를 준비합니다(말 정상 혈청) 일반적인 항체 희석: MAb 2G11 1/100 그러나 가장 낮은 배경에서 가장 강력한 라벨링을 제공하기 위해 농도를 얻기 위해 모든 새로운 배치에 작업 희석을 설정해야 합니다. 보관을 위해 최소 10μL의 부분 표본 부피를 멸균 마이크로튜브에 동결합니다. 해동하고 한 번에 하나의 부분 표본을 사용하십시오.
1차 항체 항-PrP 마우스 MAb 12F10	케이맨 화학 회사	189710	PrP142-160 소, 양 에 적합하지 않음 일반적인 항체 희석: 1/200 그러나 작동 희석도 확립되어야 합니다. MAb 2G11로 준비
Shandon CoverplateTM 챔버	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® 면역 검사 센터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining 슬라이드 랙	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	73310017
용액 구연산염 완충액(10mM pH 6.1):			1리터 정제수에 2.55g의 구연산 삼나트륨 이수화물과 0.255g의 구연산이 함유되어 있습니다. 10mM 구연산 용액(1.05mL 정제수 중 500g 구연산)을 사용하여 작업 용액의 pH를 6.1로 조정합니다 분석 당일에 준비하십시오.
Tri-sodium citrate 이수화물	시그마 알드리치	에스4641-500G
구연산	시그마 알드리치	C0759
얼룩 항아리 및 바구니	델타랩	19360
		19361
Superfrost Plus 현미경 슬라이드	폭스바겐	Tel.: 631-0108
트리스 완충 식염수(TBS)(50mM TRIZMA 염기, 0.8% NaCI, pH 7.6):			10xTBS (원액 0.5 M 트리즈마 염기, 8% NaCI, pH 7.6): 800mL 정제수에 TRIZMA 염기 60,57g 및 NaCl 80g. 염산 37%를 사용하여 원액의 pH를 조정하고 최종 부피를 정제수로 1리터로 조정합니다(5±개월까지 3°C 유지) 분석 당일에 TBS 원액 1/10을 희석합니다.
트리즈마 베이스	시그마 알드리치	T6066-1KG
염화나트륨(NaCl)	머 크	106404
크실렌	Panreac Applied Chem ITW 시약	251769	원액화되지 않음