1. 면역원의 준비
- 표 1에 설명된 조건 하에서 해당 배양 배지에서 각 시아노박테리아 균주를 성장시킵니다.
참고: 각 시아노박테리아 균주에 대한 성장 배지 및 배양 조건은 표 1에 나열되어 있습니다. K17을 제외한 모든 시아노박테리아 균주는 Autonoma University(스페인 마드리드)의 Antonio Quesada 그룹에 속합니다. Planktothrix rubescens에 대한 항체는 Vilasouto 저수지(스페인 북부)에서 이 cyanobacterium의 단일특이성 꽃의 자연 샘플에서 생성되었습니다.
- 광학 현미경으로 세포 계수 챔버를 사용하여 세포 수를 정량화하여 후기 지수 또는 고정 성장상 배양에서 약 108 cells/mL를 얻습니다.
- 5분 동안 2,000 x g에서 원심분리하여 5mL 배양액에서 세포를 수확합니다.
- 상등액을 버리고 5mL의 1x 인산염 완충 식염수(1x PBS)가 있는 10mL 튜브에 세포를 재현탁하여 약 108 cells/mL를 얻습니다.
- 휴대용 휴대용 초음파 프로세서를 사용하거나 최대 진폭(30kHz)으로 세포 교란기의 수조에 튜브를 담그면서 얼음 위에서 30-60초 동안 일시 중지하면서 각각 30초씩 초음파 처리하여 현탁액의 세포를 균질화 및 용해합니다.
- 시아노박테리아의 각 균주에 대해 1.3 - 1.5단계를 반복합니다.
참고 : 초음파 처리는 세포 파괴 및 세포 함량 방출을 생성합니다. 단백질과 다당류는 좋은 면역원이지만, 지질과 핵산과 같은 특정 분자는 그 자체로 체액성 면역원성 반응을 유도하지 않습니다. 따라서 다당류 또는 단백질과 같은 운반체에 결합하여 분자 복잡성을 증가시켜야 합니다. 또한 초음파 처리는 항체 생성을 유발할 수 있는 세포 내 물질을 방출합니다.
2. 다클론 항체 생산
- 1.5단계에서 얻은 초음파 세포 용해물 0.5mL를 완전한 Freund's adjuvant 0.5mL와 혼합하여 첫 번째 면역원 용량을 준비합니다. 다클론 토끼 항체 생산을 위한 동물 시설의 운영자에게 전달합니다.
- 1.5단계에서 얻은 것과 동일한 균질화/용해물 0.5mL를 불완전한 Freund's adjuvant인 0.5mL와 혼합하여 항체 생산 과정에서 기억력 향상으로 추가 사용을 위해 이전과 같이 3회 더 용량을 준비합니다. 항체 생산 과정을 수행하기 위해 동물 시설에 제공하십시오.
- 각각의 새로운 항체 생산 공정에 대해 2.1단계와 2.2단계를 반복합니다.
참고: 일반적으로 항체 생산은 동물과 함께 작업하기 위해 적절한 면허와 교육이 필요하기 때문에 전문 동물 시설이나 회사에 위탁됩니다. 이 회사들은 혈청 샘플에 존재하는 항원 특이적 항체의 양에 대한 상대 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 측정을 제공합니다.
3. 항체 정제
- protein-A 친화성 크로마토그래피로 2단계에서 수집한 면역 혈청과 면역 전 혈청에서 면역글로불린 G(IgG) 분획을 정제합니다. 카트리지 시스템을 기반으로 하는 일부 상업용 정화 키트는 잘 작동합니다. 제공자의 지시를 따릅니다.
- 정제 키트가 탈염 시스템을 제공하지 않는 경우, 투석 또는 100kDa(또는 그 이하) 멤브레인 공극 크기의 원심 필터 장치를 사용하여 정제된 항체를 용출한 후 완충액을 0.1x PBS로 변경합니다.
- 280nm에서 흡광도를 측정하거나 Bradford, Lowry 또는 Bicinchoninic acid (BCA)와 같은 비색 방법을 사용하여 항체 농도를 결정합니다.
참고: 용출 완충액에 아민기(예: Tris 완충액)를 포함하는 것은 피하는 것이 중요한데, 이는 에폭시기로 활성화된 고체 표면에 결합하기 위해 항체와 경쟁하기 때문입니다. 정제 후 ELISA로 항체 활성을 테스트하는 것이 중요합니다.
4. 형광 항체 라벨링
- 섹션 3에서 얻은 정제된 항체를 1mg의 단백질을 100μL의 디메틸설폭사이드(DMSO)로 라벨링하기 위한 염료가 함유된 상용 바이알을 용해하여 형광 색소(예: 원적색 형광 염료)로 라벨링합니다. 50mM 인산염 완충 식염수(pH 8.5)에서 최종 부피 50μL에 2mg/mL의 농도로 용해된 염료 2μL를 각 항체 제제에 추가합니다.
- 진동 플랫폼에서 상온에서 1시간 동안, 1,200rpm에서 1시간 동안 연속 교반 하에서 라벨링 반응을 유지합니다.
- 공급업체 권장 사항에 따라 크기 배제 크로마토그래피(예: 컬럼에 포획된 1.5 - 30kDa의 분획 범위를 가진 겔 사용)로 라벨링된 항체를 정제합니다.
- 용리액에서 280nm 및 650nm에서 흡광도를 측정하고 공급업체 권장 사항에 따라 라벨링 효율성을 계산합니다.
참고: 단백질 1mg을 라벨링하기 위해 형광 염료 단일 바이알로 최대 50 x 50μL 항체 라벨링 반응을 수행할 수 있습니다. 튜브를 알루미늄 호일로 덮거나 4.3단계 후 담금질 과정을 피하기 위해 불투명한 0.5mL 튜브를 사용하는 것이 좋습니다. IgG 항체의 경우, 항체 몰당 3-7 mol의 염료로 최적의 라벨링이 이루어집니다.
5. CYANOCHIP 생산
- 프린팅 용액의 항체 및 대조군
- 각 항체를 상용 1x 단백질 인쇄 버퍼에 0.01%(v/v) Tween 20(비이온 세제)과 함께 1mg/mL로 혼합하여 인쇄 용액에 정제된 각 항체 30μL를 모두 최종 농도로 준비합니다.
참고: 대안적으로, 항체 용액은 탄산염 완충액(pH 8.5)에 20% 글리세롤, 1%(w/v) 자당(또는 방부제로서의 트레할로스) 및 0.01%(v/v) Tween 20을 포함할 수 있습니다.
- 대조군으로 인쇄 용액 30μL를 준비합니다: (a) 0.01% (v/v) Tween 20이 포함된 1x 단백질 인쇄 버퍼, (b) 0.01% (v/v) Tween 20이 포함된 1x 단백질 인쇄 버퍼에서 1mg/mL의 단백질-A 정제된 사전 면역 혈청, (c) 0.01%(v/v) Tween 20이 포함된 1x 단백질 인쇄 버퍼에서 1mg/mL의 소 혈청 알부민(BSA).
- 5.1.1단계와 같이 Tween 20을 사용하여 1x 단백질 프린팅 버퍼에 다양한 농도(예: 50μg/mL에서 1μg/mL까지)로 형광 표지되고 정제된 사전 면역 혈청 30μL를 준비합니다. 이 샘플은 형광 프레임 마커로 사용되며 스포팅 후 상대 형광 정량화에 사용됩니다.
- 5.1.1, 5.1.2 및 5.1.3 단계에서 준비한 인쇄 용액의 웰당 30μL를 폴리프로필렌과 같은 마이크로어레이 제조를 위한 최고 품질의 384웰 마이크로플레이트에 추가합니다.
참고: 단백질 프린팅 버퍼는 항체의 품질과 안정성을 증가시키고, Tween 20은 스폿 형태를 균질화하고 단백질 결합을 구축합니다. 사용하기 전에 384웰 마이크로플레이트를 4°C로 유지하는 것이 좋습니다. -20 °C에서 장기간 보관하십시오. 폴리프로필렌은 DNA, 단백질, 세포 추출물 및 저분자 고유 결합이 낮습니다.
- 현미경에 항체 프린팅 슬라이드
참고: 접촉식, 분할 바늘 또는 압전 프린터 또는 "잉크젯" 기술과 같은 비접촉 장치와 같은 다양한 어레이 플랫폼을 사용하여 활성 현미경 슬라이드에 항체를 인쇄합니다. 이 작업에서 CYANOCHIP은 μm 규모에서 nL 수량의 항체를 탐지할 수 있는 로봇 시스템(어레이어)을 사용하여 접촉을 통해 일상적으로 인쇄되었습니다.
- 인쇄실의 환경 조건을 20 °C 및 40 - 50% 상대 습도로 설정합니다.
- 슬라이드 기판(예: 75 x 25mm 에폭시 활성화 현미경 유리 슬라이드)을 설정하여 각 슬라이드에서 여러 개의 동일한 항체 어레이를 수행합니다.
- 대조군과 reference frame을 포함한 각 정제된 항체를 삼중 스폿 패턴으로 스폿합니다. 이러한 조건에서 스폿의 직경은 180 - 200 μm입니다.
- 인쇄 후에, 주위 온도에 적어도 30 분 동안 주위 온도를 위한 그(것)들을 말리게 하기 위하여 남겨두고, 그 후에 4개의 °C에 저장하십시오; 분야에서 일을 위해, 활주는 몇 달 동안 주위 온도에 수송되고 저장될 수 있습니다.
참고: CYANOCHIP은 슬라이드당 3 x 8 동일한 마이크로어레이 또는 1 x 9 마이크로어레이 형식의 9개의 동일한 어레이가 있는 삼중 스폿 마이크로어레이 형식으로 인쇄됩니다. 각 어레이 크기는 24웰 개스킷(3 x 8 혼성화 챔버에서 일반적으로 7.5 x 6.5mm)의 반응 챔버 치수보다 높아서는 안 됩니다.
- 마이크로어레이를 사용하여 환경 샘플을 분석하기 전에 형광 샌드위치 마이크로어레이 면역분석법(FSMI)을 사용하여 적정 곡선의 각 항체에 대한 작동 희석을 측정합니다. 각 항체에 대해 해당 면역원의 표준 농도(103 - 104 cells/mL)와 형광 항체의 연속 희석(1:500 - 1:32,000)을 사용합니다. 최적의 항체 농도는 적정 곡선에서 얻은 최대 신호 강도의 50%에 해당합니다. 또한, 각 항체에 대한 민감도 및 특이도는 문헌[Blanco et al]에 기술된 바와 같이 결정되어야 합니다.
6. FSMI(Fluorescent Sandwich Microarray Immunoassay)를 위한 환경 다중 분석물 추출물 준비
- 액체 샘플에서 추출한 다중 분석물 추출물
- 멸균 주사기(예: 저수지 해안의 물)로 1 - 100mL의 액체 샘플을 채취하십시오. 샘플의 양은 대상의 잠재적 농도에 따라 크게 달라집니다.
- 3-μm 공극 크기, 47mm 직경의 폴리카보네이트 필터를 통해 물 샘플을 통과시켜 세포를 농축합니다. 양성 검출을 위해서는 103 - 108 cells/mL 사이의 세포 농도가 바람직하지만 실제 농도는 알려져 있지 않습니다.
- 필터에 수집된 바이오매스를 변형된 Tris-buffered saline 1mL, Tween 20-reinforced buffer(TBSTRR; 0.4 M Tris-HCl(pH 8), 0.3 M NaCl 및 0.1% Tween 20)로 주걱으로 긁어 15-mL 튜브에 넣습니다.
- 단계 1.5에서 기술된 것과 같이 휴대용 초음파 가공업자를 사용하여, 또는 다만 여기저기 여러 번 피펫팅해서 균질화하고 분해하십시오; 이것은 microarray에 의하여 분석을 위한 표본을 준비합니다.
- 고체 시료에서 추출한 다중 분석물 추출물
- 최대 0.5g의 고체 샘플(예: 암석, 토양 또는 퇴적물)을 10mL 튜브에 넣고 최대 2mL의 TBSTRR을 추가합니다.
- 초음파 발생기 프로브를 튜브에 담그거나, 튜브를 강력한 초음파 발생기 혼의 수조에 담그거나, 휴대용 초음파 발생기를 사용하여 초음파 처리합니다. 30kHz에서 최소 5 x 30초 주기를 수행하고 얼음 위에서 30초 동안 멈춥니다.
- 직경 10-12mm, 공극 크기 5-20μm 나일론 필터 홀더에 결합된 10mL 주사기로 모래, 점토 및 기타 거친 물질을 제거하는 필터. 샘플을 밀어 넣습니다.amp필터를 통해 1.5mL 튜브에 넣습니다. 필터가 포화되면 주사기의 현탁액을 교반하고 새 것으로 가져 가십시오. 이것은 면역 분석을 위해 여과액 물질을 준비합니다(7단계).
참고: TBSTRR의 버퍼링 용량은 샘플 유형에 따라 다릅니다. 환경 추출물을 준비한 직후 면역분석을 수행하여 분석물에 대한 효소 분해의 영향을 방지하는 것이 중요합니다. 또는 환경 추출물에 프로테아제 억제제를 첨가하고 다음 단계까지 -80°C에서 동결합니다.
7. 형광 샌드위치 마이크로어레이 면역분석법(FSMI)
- CYANOCHIP 차단
알림: 사용 직전에 인쇄된 슬라이드를 처리하여 슬라이드의 모든 유리 에폭시기를 차단하고 과도한 비공유 결합 항체를 제거하십시오.
- 5분 동안 로커 플랫폼에서 가벼운 교반으로 깨끗한 표면(예: 페트리 접시 또는 50mL 튜브)에 5%(w/v) BSA 용액이 있는 0.5M Tris-HCl(pH 9)에 마이크로어레이를 담그십시오.또는 마이크로어레이 스폿이 마주보고 있는 위 용액의 100-200μL 방울 위에 슬라이드를 놓습니다. 3 - 5 분 동안 그대로 둔 다음 계속 진행하십시오.
- 끝이 플라스틱인 집게를 사용하여 슬라이드를 조심스럽게 집으십시오. 마이크로어레이 영역을 만지지 않도록 하십시오. 종이 타월에 슬라이드를 부드럽게 두드려 과도한 액체를 제거하십시오. 로커 플랫폼에서 가벼운 교반으로 0.5 % (w / v) BSA 용액과 함께 8 M Tris-HCl (pH 8)에 2 분 동안 30 분 동안 담그십시오.
- 현미경 슬라이드에 적합한 상용 마이크로 원심분리기를 사용하여 짧은 원심분리(200 - 300 x g, 1분 동안)를 수행하여 슬라이드를 건조시킵니다. 또는 종이 타월을 부드럽게 두드려 슬라이드를 말리십시오.
- 마이크로어레이를 사용한 다중 분석물 시료 추출물의 배양
- 다수 microarrays를 위한 24의 우물을 가진 상업적인 microarray 혼성화 카세트에 있는 슬라이드를 설치하십시오; 공급자 지시를 따르십시오.
- 슬라이드 및 카세트 조립 후 최대 50μL의 시료 추출 또는 TBSTRR로 희석하여 카세트의 각 웰에 피펫팅합니다.
- 분석할 각 샘플에 대해 7.2.2단계를 반복합니다.
- 블랭크 대조군으로, 50 μL의 TBSTRR 버퍼를 피펫으로 카세트의 최소 두 개의 별도 웰에 넣습니다.
- 15분마다 피펫팅을 하거나 가볍게 흔든 상태로 두면서 혼합하면서 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 또는 4 ° C에서 12 시간 동안 배양하십시오 .
참고: 마이크로어레이 패턴의 기능으로 다른 인큐베이션 개스킷을 사용하십시오. 7.2.5단계에서 배양의 시간과 온도는 일반적으로 각 쌍을 이룬 항원-항체의 친화력 및 결합 동역학에 의존하는 경험적 매개변수입니다.
- 세탁
- 카세트를 내려놓고 깨끗하고 흡수성이 좋은 종이에 조심스럽게 두드려 샘플을 제거합니다.
- 위와 같이 각 웰에 150μL의 TBSTRR을 첨가하여 웰을 세척하고 완충액을 제거합니다.
- 7.3.2단계를 세 번 더 반복합니다.
- 형광 검출기 항체를 이용한 배양
- 17개의 항시아노박테리아 균주 항체를 포함하는 항체 혼합물 50μL를 첨가하고, 각각 1%(w/v) BSA로 TBSTRR의 형광 색소로 표지됩니다. 각 항원/항체 쌍의 적정 실험을 수행하여 혼합물 내 각 형광 항체의 농도(0.7 - 2 μg/mL)를 측정합니다.
- 7.2.5 단계에서 설명한대로 주변 온도에서 1 시간 동안 또는 4 ° C에서 12 시간 동안 배양합니다.
- 형광 항체 세척
- 7.3단계와 같이 결합되지 않은 형광 항체를 제거합니다.
- 카세트를 분해하고 슬라이드를 0.1x PBS(예: 50mL 튜브)에 담그면 빠르게 헹굴 수 있습니다.
- 7.1.3단계와 같이 슬라이드를 건조시킵니다.
8. 형광 스캐닝
- 형광 스캐너에서 원적외 형광 염료에 대한 최대 방출 형광 피크에서 형광을 위해 슬라이드를 스캔합니다. 일반적으로 레이저 게인 값을 낮추어 서로 다른 스캐닝 매개변수에서 마이크로어레이의 여러 이미지를 촬영합니다.
메모: 포화 반점(> 65,000 형광 수)을 피하십시오 - 이러한 반점은 스케일을 벗어나 정량화 오류를 유발할 수 있습니다.
표 1. CYANOCHIP을 생산하는 데 사용되는 항체(abs) 및 시아노박테리아 균주 목록.
| Ab 코드 | 면역원(균주) | 주문 | 주소 | 보통 | 문화권 조건 |
| K1 | 아나바에나 sp. | 노스토칼레스 | 알려지지 않은 | BG11 및 질산염 | 30ºC, 연속광 |
| K2 | 아나바에나 sp. | 노스토칼레스 | 알려지지 않은 | BG11o | 30ºC, 연속광 |
| K3 | 마이크로시스티스 플로사쿠아 | 융모균 | 플랑크톤 | BG11 | 28ºC, 연속광 |
| K4 | 마이크로시스티스 노바체키 | 융모균 | 플랑크톤 | BG11 | 28ºC, 연속광 |
| K5 | 녹농균(Microcystis aeruginosa) | 융모균 | 플랑크톤 | BG11 | 28ºC, 연속광 |
| K6 | Aphanizomenon ovalisporum | 노스토칼레스 | 플랑크톤 | BG11o | 28ºC, 연속광 |
| K7 | 포르미듐 sp. | 오실레이터 | 저서 | BG11 | 18ºC, 16-8 광주기 |
| K8 | Rivularia sp. | 노스토칼레스 | 저서 | 츄-디 | 18ºC, 16-8 광주기 |
| K9 | Chamaesiphon sp. | 융모균 | 저서 | BG11 | 18ºC, 16-8 광주기 |
| K10 | 렙톨뤼뱌 보리아나 | 오실레이터 | 저서 | BG11 | 18ºC, 16-8 광주기 |
| K11 | 톨리포스릭스 디스토르타 | 노스토칼레스 | 저서 | BG11o | 18ºC, 16-8 광주기 |
| K12 | Aphanizomenon aphanizomenoides | 노스토칼레스 | 플랑크톤 | BG11o | 28ºC, 연속광 |
| K13 | Nostoc sp. (남극 대륙) | 노스토칼레스 | 저서 | BG11o | 13ºC, 16-8 광주기 |
| K14 | 아나바에나 sp. | 노스토칼레스 | 저서 | BG11o | 13ºC, 16-8 광주기 |
| K15 | Leptolyngbya sp. | 오실레이터 | 저서 | BG11 | 13ºC, 16-8 광주기 |
| K16 | 톨리포스릭스 sp. | 노스토칼레스 | 저서 | BG11 | 13ºC, 16-8 광주기 |
| K17 | 플랑크토스릭스 루베센스 | 오실레이터 | 플랑크톤 | 없음 | 없음 |