3D 하이드로겔 시스템에 캡슐화된 세포의 면역염색

초록

출처: LeSavage, B. L., et al. 3D에서 세포의 캡슐화 및 면역 염색을 위한 엘라스틴 유사 단백질 하이드로겔 생산. J. Vis. Exp. (2018).

이 동영상은 3D 하이드로겔로 캡슐화된 세포를 면역 염색하는 기술을 보여줍니다. 신경전구세포를 포함하는 하이드로겔 배양액은 고정, 투과화 및 차단 용액으로 처리되어 비특이적 면역 염색을 방지합니다. 특정 단백질에 결합하기 위해 1차 항체 칵테일을 첨가한 다음 형광 표지된 2차 항체와 핵 염색을 추가합니다. 그런 다음 샘플을 슬라이드에 장착하고 컨포칼 현미경으로 관찰합니다.

프로토콜

1. 3D 엘라스틴 유사 단백질(ELP) 하이드로겔의 세포 캡슐화

1. 실리콘 몰드의 준비
   1. 원하는 직경의 생검 펀치를 사용하여 0.5mm 두께의 실리콘 시트에 구멍을 만들고 각 구멍 주위에 사각형을 자릅니다. 원하는 금형 수에 대해 반복합니다.
      참고: 금형의 직경과 두께는 특정 응용 프로그램 및 세포 배양 조건에 맞게 조정할 수 있습니다. 실제로 50 x 10⁶ cells/mL의 세포 배양의 경우 충분한 DNA/RNA 및 단백질 추출을 위해 각각 4mm 및 5mm 직경의 0.5mm 두께 몰드가 권장됩니다. 면역 염색의 경우, 2mm 생검 펀치를 사용하여 정사각형 주형당 3개의 인접한 구멍을 만들어 웰당 3개의 반복물을 염색할 수 있습니다.
   2. 핀셋으로 개별 금형의 양쪽에 있는 플라스틱 랩을 제거합니다.
      메모: 오염은 향후 플라즈마 결합 효율을 감소시킬 수 있으므로 노출된 실리콘 표면과의 접촉을 피하십시오.
   3. 핀셋을 사용하여 동일한 수의 베어 실리콘 몰드와 유리 커버 슬립 (1 번, 직경 12mm)을 48 웰 플레이트의 거꾸로 된 뚜껑에 교대로 배열합니다.....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3D ELP 하이드로겔의 세포 캡슐화
0.22μm 실린지 필터	밀리포어	SLGV004SL
0.5mm 두께의 실리콘 시트	전자 현미경 과학	제70338-05
24웰 조직 배양 플레이트	코 닝	353047
일회용 생검 펀치 (2mm)	인테그라 밀텍스	33-31
일회용 생검 펀치 (4mm)	인테그라 밀텍스	33-34
일회용 생검 펀치 (5mm)	인테그라 밀텍스	33-35
둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)	코 닝	21-031-CM
No. 1 12mm 유리 커버 슬립	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제12-545-80
테트라키스(하이드록시메틸)포스포늄 클로라이드(THPC)	시그마-알드리치	404861-100ML
0.5% 트리스핀/EDTA	써모 피셔	15400054
3D ELP 하이드로겔 내 세포의 면역세포화학(Immunocytochemistry of Cells
16%(w/v) 파라포름알데히드(PFA)	전자 현미경 과학	15701
소 혈청 알부민(BSA)	로슈	3116956001
DAPI (4', 6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드)	분자 프로브	D1306 (영어
당나귀 세럼	램파이어 생물학 연구소	7332100
염소 안티-마우스 2차 항체 (AF488)	분자 프로브	A-11017
염소 항토끼 2차 항체 (AF546)	분자 프로브	A-11071
염소 세럼	지브코	제16210-072
Mouse Nestin 일차 항체	BD 파밍겐	556309
Mouse Sox2 1차 항체	세포 신호 전달 기술	23064분
매니큐어	전자 현미경 과학	72180
트리톤 X-100	시그마-알드리치	X100-100ML
Vectashield 하드셋 마운팅 미디엄	벡터 랩스	H-1400

호 년 년 분 ) 호 ) 년 ) (영문) 호 시리즈