1. 3D 엘라스틴 유사 단백질(ELP) 하이드로겔의 세포 캡슐화
- 실리콘 몰드의 준비
- 원하는 직경의 생검 펀치를 사용하여 0.5mm 두께의 실리콘 시트에 구멍을 만들고 각 구멍 주위에 사각형을 자릅니다. 원하는 금형 수에 대해 반복합니다.
참고: 금형의 직경과 두께는 특정 응용 프로그램 및 세포 배양 조건에 맞게 조정할 수 있습니다. 실제로 50 x 106 cells/mL의 세포 배양의 경우 충분한 DNA/RNA 및 단백질 추출을 위해 각각 4mm 및 5mm 직경의 0.5mm 두께 몰드가 권장됩니다. 면역 염색의 경우, 2mm 생검 펀치를 사용하여 정사각형 주형당 3개의 인접한 구멍을 만들어 웰당 3개의 반복물을 염색할 수 있습니다.
- 핀셋으로 개별 금형의 양쪽에 있는 플라스틱 랩을 제거합니다.
메모: 오염은 향후 플라즈마 결합 효율을 감소시킬 수 있으므로 노출된 실리콘 표면과의 접촉을 피하십시오.
- 핀셋을 사용하여 동일한 수의 베어 실리콘 몰드와 유리 커버 슬립 (1 번, 직경 12mm)을 48 웰 플레이트의 거꾸로 된 뚜껑에 교대로 배열합니다. 완료되면 오염을 방지하기 위해 48웰 플레이트의 뚜껑을 덮습니다.
- 산소 플라즈마는 48웰 플레이트 뚜껑 전체(즉, 금형 및 유리 슬라이드)를 처리합니다. 그 직후 집게를 사용하여 실리콘 몰드를 인접한 유리 커버슬립에 뒤집습니다. 접착을 위해 금형을 단단히 누르십시오. 곰팡이를 실온에서 1시간 동안 배양
합니다.
메모: 산소 플라즈마 처리 기간은 사용하는 기기에 따라 다릅니다. 당사 기기의 일반적인 조건은 0.3-4mbar 사이의 작동 가스 압력 창, 20cm3/min의 산소 가스 유량, 10-20초 동안 플라즈마에 대한 샘플 노출입니다.
- 오토클레이브로 금형을 살균하십시오. 사용할 때까지 금형을 실온의 멸균 환경에서 보관하십시오.
메모: 금형은 이 단계에서 무기한 보관할 수 있습니다.
- 엘라스틴 유사 단백질 스톡 용액의 제조
- 동결건조된 ELP를 4°C 보관에서 제거합니다. 튜브를 열기 전에 단백질을 실온으로 데워 반복 사용으로 인해 단백질에 응결이 생기지 않도록 하십시오.
- 하룻밤 동안 지속적인 교반(즉, 회전)으로 4°C에서 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)에 ELP를 용해합니다.
메모: ELP 원액 농도는 사용자 정의 부피 비율로 가교제 용액을 첨가하여 추가로 희석됩니다. 예를 들어, 최종 ELP 농도가 3%(w/v)인 경우 ELP 용액:교차결합제 용액의 4:1 부피 비율로 희석될 3.75%(w/v) ELP 원액을 준비합니다. 원하는 용도에 따라 농도를 조정합니다.
- 0.22μm 주사기 필터를 사용하는 멸균 필터 ELP 원액. ELP를 사용하지 않을 때는 얼음 위에 보관하십시오.
- 생물 안전 캐비닛에서 멸균 핀셋을 사용하여 멸균 주형을 24웰 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.
- 테트라키스(하이드록시메틸)포스포늄 클로라이드(THPC) 원액의 제조
- 사용 직전에 DPBS에 THPC를 희석하십시오. 최종 ELP 농도와 원하는 가교 비율에 따라 THPC 용액의 농도를 조정합니다.
메모: 프로토콜의 경우, ELP 원액과 THPC 용액을 4:1의 부피 비율로 혼합하여 최종 ELP 농도 3%(w/v)를 만듭니다. 필요에 따라 조정합니다.
- 2.6μL의 THPC 용액(물 중 80%)을 997.4μL의 DPBS.
에 추가합니다.
메모: 이 THPC 농도는 최종 3%(w/v) ELP 하이드로겔에 대해 설명된 4:1 부피 비율로 용액을 혼합할 때 THPC의 하이드록시 메틸기와 ELP 단백질의 1차 아민의 1:1 화학량론적 비율에 해당합니다. THPC 용액은 점성이 있으며 용액 방울이 피펫 팁 측면에 달라붙을 수 있습니다. 정확한 농도를 위해 DPBS로 희석할 때 이러한 물방울을 피하십시오. THPC 스톡 용기를 질소 가스로 퍼지하여 포스핀의 산화 및 교차결합제의 비활성화를 방지합니다.
- Vortex는 혼합하고 얼음에 보관할 수 있는 솔루션입니다.
- 멸균 필터는 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 THPC 원액을 사용합니다. THPC 원액을 멸균 DPBS로 더 희석하여 더 낮은 화학량론적 가교 비율(예: 0.5:1 또는 0.75:1)을 달성합니다.
메모: THPC는 산소에 민감하며 희석된 용액은 준비 후 몇 시간 이내에 사용해야 합니다.
- Trypsin-EDTA를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 배양하여 세포를 해리하고, 세포를 펠렛화하고, 혈구계를 사용하여 배지에서 다시 현탁된 세포를 계수합니다.
메모: 이 단계에 대한 정확한 프로토콜은 원하는 세포 유형과 응용 분야에 따라 크게 달라집니다. 이 프로토콜 전반에 걸쳐 사용되는 신경전구세포에 대해 실온에서 1.5분 동안 0.025% 트립신-EDTA 배양을 수행했습니다. 세포를 200 x g에서 2분 동안 펠렛화했습니다. 세포 생존율을 높이려면 세포를 정상적인 배지 조건에서 부유해야 합니다. 세포 캡슐화에 사용되는 일반적인 세포 밀도는 최종 하이드로겔 부피의 1 - 50 x 106 cells/mL 범위입니다. 필요에 따라 조정합니다.
- 원하는 수의 세포를 멸균 1.5mL 원심분리 튜브에 분취합니다.
- 3분 동안 ~200 x g에서 세포를 원심분리합니다. 조심스럽게 상층액을 흡인하고 세포 펠릿을 얼음 위에 보관합니다.
메모: ELP 및 THPC 교차결합제의 추가 희석을 완화하기 위해 모든 상층액을 완전히 흡인하는 것이 중요합니다. 특정 원심분리 속도는 세포 유형에 따라 다릅니다.
- 부피가 최종 부피의 80%가 되도록 ELP 원액에 셀 펠릿을 다시 현탁시킵니다(ELP 용액:THPC 용액의 4:1 비율로 가정). 피펫을 20-25회 혼합하여 세포와 ELP.
의 균질한 혼합물을 생성합니다.
메모: ELP의 온도 상승 및 후속 상전이를 완화하기 위해 튜브 바닥을 잡지 마십시오. 3회 반복된 각 2mm 금형에는 3개의 구멍(즉, 구멍당 2.5μL의 최종 부피)으로 균등하게 분할된 7.5μL의 최종 부피(즉, 6μL의 ELP 스톡 용액 및 1.5μL의 THPC 스톡 용액)가 필요합니다. 4mm 및 5mm 금형의 경우 각각 7.5μL 및 15.5μL의 최종 부피가 필요합니다.
- 나머지 20%의 최종 부피에 대해 셀/ELP 현탁액에 THPC 원액을 추가합니다. 피펫은 20-25회 혼합하여 균일한 혼합물을 생성합니다.
- 해당 최종 부피의 cell/ELP/THPC 혼합물을 원형 운동으로 각 금형에 즉시 피펫팅합니다. 모든 금형에 대해 반복합니다.
- 샘플을 실온에서 15분 동안 배양한 다음 37°C에서 15분 동안 추가로 배양합니다.
메모: 첫 번째 배양 기간은 ELP의 저임계 용액 온도(LCST) 이상으로 온도를 높이고 열상 분리를 유도하기 전에 하이드로겔의 초기 가교결합을 촉진하는 데 도움이 됩니다.
- 750μL의 따뜻한 세포 배양 배지를 24웰 플레이트의 각 웰에 천천히 첨가하여 겔이 중단되지 않도록 합니다.
- 하이드로겔을 37°C에서 7일 동안 배양합니다.
메모: 세포 유형에 따라 1-2일마다 배지를 완전히 교체하는 것이 좋습니다. 겔에 가해지는 응력을 제한하려면 웰에서 배지를 흡입할 때 200μL 피펫 팁이 부착된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하십시오.
2. 3D ELP 하이드로겔 내 세포의 면역세포화학
- 30mL DPBS에 10mL 16%(w/v) 파라포름알데히드(PFA)를 혼합하여 고정 용액을 준비합니다. 용액을 37 °C로 가열합니다.
- 24웰 플레이트에서 배지를 흡입하고 1mL의 DPBS로 부드럽게 세척합니다.
- 각 웰에 750μL의 고정 용액을 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. PFA 증기로 다른 배양물이 오염되는 것을 방지하기 위해 조직 배양 인큐베이터를 사용하지 마십시오.
- 각 우물에서 고정 용액을 조심스럽게 흡인하고 PFA를 적절한 유해 폐기물 용기에 버리십시오.
주의: PFA에 노출되면 피부와 눈에 자극을 유발할 수 있습니다. 장갑/보안경을 착용하고 화학 연기 후드에서 작업하십시오.
- 각 샘플에 DPBS 1mL를 추가합니다. 즉시 DPBS를 흡입하고 PFA 폐기물 용기에 폐기합니다.
- 1mL의 DPBS로 샘플을 각각 10분 동안 두 번 세척합니다.
메모: 샘플은 파라필름으로 플레이트를 밀봉한 후 최대 일주일 동안 4°C의 DPBS에 보관할 수 있습니다.
- 각 시료를 750μL의 투과화 용액(100mL의 DPBS 및 0.25mL의 Triton X-100; PBST)를 15rpm의 로커에서 실온에서 1시간 동안 사용합니다.
- PBST를 흡입하고 각 샘플에 750μL의 차단 용액(PBS 95mL, 소 혈청 알부민(BSA) 5g, 혈청 5mL, Triton X-100 0.5mL를 추가합니다. 실온에서 15rpm으로 로커에서 3시간 동안 배양합니다
메모: 차단 용액에는 2차 항체가 증가한 숙주 종(예: 염소, 당나귀)의 혈청이 포함되어야 하며 사용 전에 0.22μm 필터를 통해 멸균 여과되어야 합니다.
- 항체 희석 용액(DPBS 97mL, BSA 2.5g, 혈청 2.5mL(EPL을 제조하는 동일한 숙주 종) 및 Triton X-100 0.5mL)를 준비합니다. 항체 희석 용액을 사용하여 1차 항체를 희석하고 각 샘플에 용액 500μL를 추가합니다. 파라필름으로 플레이트를 밀봉하고 로커에서 4°C에서 밤새 배양합니다.
메모: Nestin 및 Sox2 1차 항체는 제조업체의 원래 농도에서 항체 희석 용액으로 1:400 희석되었습니다.
- 각 샘플에서 항체 용액을 흡입하고 15rpm의 로커에서 실온에서 60분 동안 PBST로 샘플을 세척합니다. 세탁 단계를 3회 반복합니다.
- 항체 희석 용액을 사용하여 2차 항체와 5mg/mL 스톡 DAPI(1:2,000)를 희석하고 각 샘플에 용액 500μL를 추가합니다. 24웰 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 로커에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
메모: 2차 항체는 빛에 민감하기 때문에 모든 후속 단계에서 샘플이 광표백되지 않도록 보호해야 합니다. 염소 항-마우스 및 염소 항-토끼 2차 항체를 제조업체의 원래 농도에서 항체 희석 용액에 1:500으로 희석했습니다.
- 각 샘플에서 항체 용액을 흡인하고 로커에서 실온에서 30분 동안 PBST로 샘플을 세척합니다. 세탁 단계를 3회 반복합니다.
- 하드 설정된 장착 매체 한 방울을 유리 슬라이드 표면에 놓습니다. 집게를 사용하여 종이 타월로 금형의 가장자리를 가볍게 닦아 금형에서 과도한 용액을 제거합니다. 금형을 장착 매체에 조심스럽게 거꾸로 놓고 기포가 생기지 않도록 합니다.
- 실온에서 장착 매체가 48시간 동안 경화되도록 합니다. 샘플을 실온 또는 4°C에서 보관하십시오. 경화 과정에서 배지의 굴절률이 변하므로 이미징하기 전에 장착 매체를 48시간 동안 완전히 설정하십시오. 오염 또는 시료 이동을 완화하기 위해 투명한 매니큐어로 시료를 유리 덮개 슬라이드에 밀봉합니다.
- 컨포칼 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다.
