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1. 항체 펩타이드 접합
참고: NLS(ChAcNLS)에 연결된 콜산은 모든 상용 펩타이드 제조업체 또는 대학 제휴 펩타이드 합성 서비스 플랫폼에서 합성할 수 있습니다.
- 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에서 pH 7.6의 인산염 완충 식염수(PBS)에 10mg/mL(~1mg 총 항체) 7.6G3 용액을 준비합니다.
- 설포숙시니미딜 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(sulfo-SMCC)를 5-10mM의 농도로 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시킵니다. 용액을 완전히 볼텍싱하는 것이 완전한 용해를 달성하기 위해 가장 잘 작동합니다.
- 7G3가 들어있는 튜브에 용존 황 -SMCC 용액 (일반적으로 원하는 sulfo-SMCC-to-7G3의 몰 비율에 따라 5-20 μL 사이)을 추가합니다. sulfo-SMCC-to-7G3 비율을 10, 25 및 50:1로 테스트하는 것이 좋습니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 말레이미드 유도체화된 7G3를 한외여과 장치와 PBS, pH 7.0의 완충액 교환을 사용하여 정제하고 농축합니다. 8,000 x g에서 약 5분 동안 원심분리기 플로우 스루를 버리고 PBS, pH 7.0으로 채우고 다시 원심분리기를 합니다.
- 이 작업을 7-8회 수행하여 버퍼를 완전히 교환합니다. 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브에 필터 장치를 거꾸로 놓아 농축된 7G3 단백질을 회수합니다. 1,000 x g에서 2분간 원심분리기. 회수량은 약 0.3mL여야 합니다.
- maleimide 활성화 7G3가 들어있는 튜브에 이전 단계에서 사용 된 sulfo-SMCC-to-7G3 비율에 비해 2 배 이상의 ChAcNLS를 추가하고 4 ° C에서 밤새 배양합니다. 예를 들어, 10:1 sulfo-SMCC-to-7G3 비율이 사용된 경우 20:1 ChAcNLS-to-7G3 비율을 사용합니다. 총 볼륨은 크게 변경되지 않아야 합니다.
메모: ChAcNLS는 접합 공정 중에 침전을 일으키지 않지만, 이는 다른 펩타이드에서 발생할 수 있는 가능성입니다. 반응 중에 튜브에서 침전 징후가 있는지 관찰하십시오., 펩타이드가 소수성일 때 발생할 가능성이 가장 높습니다. 이러한 경우, 친수성을 높이기 위한 설계 변경을 위해 관심 펩타이드를 다시 검토하는 것이 좋습니다.
- 한외여과 장치를 사용하여 7G3-ChAcNLS를 PBS pH 7.4에서 원하는 농도 및 완충액 교환으로 농축합니다(1.4단계 참조). 총 단백질의 회수율은 원래 출발 물질의 75% ≥이어야 합니다.
- 12% 폴리아크릴아미드 겔(비접합 사슬에서 ChAcNLS 접합 중쇄 및 경쇄의 충분한 분리 제공)을 사용하여 구성된 7G3-ChAcNLS 후보 물질을 평가하기 위해 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 수행합니다. 2 μL β-메르캅토에탄올이 함유된 PAGE 로딩 버퍼에 10 μg의 7G3-ChAcNLS를 혼합하고 웰에 로드합니다.
- 적절한 전압(12% 젤의 경우 120V에서 1시간 동안)을 설정하고 전기영동을 실행합니다. Coomassie 염료 전면이 겔의 바닥에 도달하면 전기영동을 중지합니다.
메모: Coomassie 염료 앞면이 젤에서 흘러내리지 않도록 하십시오.
- 전기영동 장치에서 젤을 제거하고 10% v/v의 빙초산과 20% v/v 메탄올을 함유한 탈염 용액으로 헹굽니다.
- 젤과 눈금자로 겔의 사진을 찍고 표준물질 및 7G3 접합체에 대해 마이그레이션된 거리(cm)를 측정합니다. 머무름 계수(Rf) 값을 계산하는데, 이는 이동한 거리를 겔 길이(단백질이 로드된 곳에서 Coomassie 이동 전선까지)로 나눈 값입니다. 각 단백질 표준물질의 Rf 값에 대해 로그의 분자량(MW)을 플로팅하고 7G3 접합체의 크기를 외삽합니다.
- 7G3 콘주게이트와 변형되지 않은 7G3 간의 MW 차이를 1768.5g/mol(ChAcNLS의 MW)로 나누어 항체당 펩타이드 수를 계산합니다.
- Coomassie-stained gel의 디지털 이미지를 촬영하고 밀도 측정 분석을 수행합니다. 이 시점에서 선도 후보 물질의 선택은 유의한 응집체 종을 포함하지 않는 최대 ChAcNLS 분자 수를 가진 AC를 기반으로 할 수 있습니다.
2. 세포 내 축적 평가를 위한 컨포칼 현미경 검사
참고: 관심 페이로드를 가진 제형을 개발하기 전에 펩타이드 변형 mAb의 세포 내 축적에 대한 세포 선택성을 테스트하는 것이 중요합니다. 또한 Tat은 비특이적 세포 침투 성향이 있는 것으로 나타났기 때문에 값비싼 페이로드로 비용이 많이 드는 개발 단계를 수행하기 전에 먼저 세포 내 축적 및 세포 선택성을 분석하는 것이 좋습니다. 이러한 이유로 절차 1은 isotype 특이적 관련 없는 control mAb도 수정해야 합니다. 프로토콜의 나머지 부분에서는 항체당 10개의 ChAcNLS 분자로 변형된 AC를 사용하여 작업할 것입니다. 절차 2와 3의 주요 단계를 포함하는 회로도는 그림 1에 설명되어 있습니다.
주의: 프로토콜의 이 단계에는 파라포름알데히드의 처리 및 조작이 포함됩니다. 취급 시 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 변형된 대조군 mAb를 포함하여 200nM의 7G3-ChAcNLS로 표적 TF-1a 세포를 처리합니다. 5 x 106 항원 양성 세포를 conjugate로 37 ° C에서 1 시간 동안 배양합니다.
- 1시간 후, 상층액을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS에서 1mL 3x로 세척합니다. 새 배지를 추가하고 37°C에서 한 시간 더 배양합니다.
- 추가 시간 후, 상등액을 제거하고 1mL의 얼음처럼 차가운 PBS에 3x 세척합니다. 0.25% 트립신과 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유한 PBS 0.5mL를 37°C에서 3분까지 3분 동안 추가합니다.
메모: 초기 파일럿 테스트 중에는 AC 세포 내 축적의 차이를 확인하기 위해 세포를 트립신화하지 않는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 트립신의 사용을 촉진하며, 이를 통해 다양한 AC 후보 물질의 세포 내 축적 효율 평가를 개선하는 방법을 보여줍니다.
- 분리되는 모든 세포를 육안으로 확인하여 배양을 위한 다양한 시간을 테스트합니다. 또한 생존능 염색 용액으로 세포 분취액을 배양하고 앞서 설명한 대로 유세포 분석을 수행합니다.
- 1.5mL의 세포 배양 RPMI 1640 배지/10% 소 태아 혈청으로 트립신을 중화합니다. 500 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 0.5mL의 얼음처럼 차가운 PBS에서 3x를 세척합니다.
- 1%의 파라포름알데히드와 1%의 수크로스가 함유된 0.5mL PBS의 세포를 얼음 위에서 30분 동안 고정합니다. 0.5mL의 얼음처럼 차가운 PBS에서 세포를 3번 세척하고 250 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 0.15% Triton X-100을 함유한 0.5mL PBS의 세포를 얼음 위에서 5분 동안 투과합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척하고 원심분리를 반복합니다.
- AlexaFluor 647에 접합된 항 쥐(isotype specific) Fc 2차 다클론 항체의 2μg/mL(또는 제조업체 권장 농도)를 포함하는 0.1mL PBS에 세포를 실온에서 1시간 동안 현탁합니다.
- 250 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하고 0.5mL 얼음처럼 차가운 PBS에서 셀을 3x 세척합니다. 0.5mL PBS.
에서 세포 현탁
일시 중지: 셀은 냉장고에 보관할 수 있습니다.
메모: 관심 mAb의 올바른 isotype을 인식하는 2차 항체를 선택하는 것이 중요합니다. AF647은 핵의 요오드화 프로피듐(PI) 염색을 방해하지 않는 원적외선 방출 때문에 선택됩니다.
- PI를 10μg/mL 농도로 세포가 있는 용기에 추가합니다. 다음으로, 장착 매체를 사용하여 1 x 105 셀을 유리 슬라이드에 장착하고 유리 커버 슬립으로 덮습니다.
- 도립 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 Plan Apo 60X 오일 이멀젼 대물렌즈 NA 1.42를 사용하여 세포를 검사합니다. 488nm 아르곤 레이저와 600 - 650nm로 설정된 스펙트럼 스캐닝 프리즘을 사용하여 PI 형광을 검출합니다. AF647 형광의 경우 633nm 헬륨-네온 레이저와 650 - 700nm용 스펙트럼 스캐닝 프리즘 세트를 사용하십시오. PI 및 AF647에서 형광 방출을 순차적으로 수집합니다.
메모: 세포를 평가하고 비교하는 동안 동일한 설정을 사용합니다. 그러나 트립신화된 세포와 트립신화된 세포에 대한 설정을 조정해야 합니다.
- 현미경 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득합니다. 1,024 x 1,024 픽셀의 연속 수평 광학 절편을 사용하여 전체 세포 두께에 걸쳐 0.5μm 간격으로 평균 2X 라인을 사용하여 이미지를 수집합니다. 최대 형광 강도에서 4개의 연속된 슬라이스에서 누적된 z-투영으로 이미지를 표시합니다.
- 현미경 소프트웨어로 세포를 분석합니다. conjugate의 세포 분포 패턴을 기록합니다. 구체적으로, 세포질의 세포 내 형광이 그룹화되어 있고 세포 표면 근처에 있는지 또는 확산되고 균질한지 평가합니다. 또한 세포당 상대적인 형광 강도를 평가합니다.
