Aβ 펩타이드 특이적 항체 및 Aβ 올리고머를 쥐 해마에 제어 주입

초록

출처: Sajadi, A., et al. 만성 아밀로이드-베타 올리고머 주입의 동물 모델에서 신경 퇴행은 삼투압 펌프가 주입된 항체 처리에 의해 중화됩니다. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 아밀로이드-베타(Aβ) 펩타이드 특이적 항체를 쥐의 해마에 지속적으로 주입하는 기술을 보여줍니다. 이 연구는 올리고머와 항체 간의 상호 작용을 연구하기 위해 쥐 해마에 용해성 Aβ 올리고머(Aβo)를 주입하는 것과 결합된 Aβ 펩타이드 특이적 항체의 제어 주입을 위해 양측 캐뉼라 시스템을 이식하는 방법을 사용합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 정위 수술 전 카테터 준비

1. 캐뉼러를 삼투압 펌프와 연결하는 데 사용할 PE50 카테터(길이 6cm)를 자릅니다(그림 1 참조). PE50 카테터에 인공 뇌척수액(aCSF)을 채우고 카테터의 양쪽 끝을 밀봉합니다. 사용할 때까지 카테터를 4°C로 유지하십시오.

2. 입체택시에 의한 캐뉼라 이식

1. 멸균 상태에서 수술을 수행하십시오. 고압증기멸균으로 모든 수술 기구와 재료를 살균합니다. 입체택시 장치와 작업 영역을 철저히 청소하고 70% 에탄올 용액으로 소독합니다. 수술용 마스크, 헤어 보닛, 멸균 장갑을 착용하십시오.
2. 케타민과 자일라진 용액(각각 100mg/kg 및 10mg/kg)을 복강내(i.p)로 주입하여 쥐를 마취합니다. 발가락을 부드럽게 꼬집은 후 움직임을 확인하여 마취를 확인합니다.
3. 수술 최소 30분 전에 마취된 동물에게 비스테로이드성 항염증제(Meloxicam, 1mg/kg)를 피하(s.c.) 주사합니다.
4. 이발기를 사용하여 동물의 머리를 면도하고 클로르헥시딘 글루코네이트 2%와 이소프로필 알코올 2% 용액으로 피부를 세 번 소독합니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 수의학 안과 연고를 바르십시오.
5. 이어바가 있는 입체 프레임에 동물을 놓습니다. 입체성 프레임의 홀더 암에 캐뉼라 하나를 고정합니다. 머리 꼭대기에 국소 마취제(부피바카인(1.5mg/kg) 및 리도카인(1.5mg/kg)을 주사합니다. 마취는 3% 이소플루란을 전달하는 콧방울을 배치하여 전체 절차 동안 유지됩니다. 전체 수술 분야는 드레이프되어야 하지만, 기술을 더 잘 보여주기 위해 여기서는 수행하지 않았습니다.
6. 메스로 정수리를 3cm 정도 절개합니다. 두개골을 깨끗하게 유지하기 위해 절개 부위 주위에 4개의 클램프를 설치합니다. 둥근 끝 가위를 사용하여 동물의 견갑골 사이의 피부 아래에 주머니 (2 x 2cm²)를 만듭니다.
7. 칼날로 두개골의 골막을 긁어냅니다. 피가 나는 경우 두개골에 거즈 패드를 바르십시오.
8. 두개골이 평평하고 입정선 프레임에 잘 정렬되어 있는지 확인합니다. 두개골이 평평한지 확인하려면 브레그마와 람다에서 높이 좌표를 확인합니다. 기준점으로 사용할 브레그마 좌표를 가져옵니다.
9. 브레그마에서 시작하여 해마에 양측으로 이식될 두 가이드 캐뉼라의 좌표를 계산합니다(Paxinos 및 Watson 쥐 뇌 아틀라스에 따르면 전후: -0.42cm, 내측: ± 0.30cm, 배복부: -0.28cm). 마커로 캐뉼라의 위치를 나타냅니다.
10. 두 캐뉼라의 착상 지점에서 두개골에 구멍(0.5mm)을 뚫습니다. 해당 지점의 위와 아래에 약 5mm의 다른 두 개의 구멍을 뚫어 치과 시멘트를 적용할 때 캐뉼라를 응고시킬 나사를 삽입합니다.
11. 이전에 aCSF로 채워진 카테터의 한쪽 끝을 메스로 잘라 캐뉼라의 앵글 암에 삽입합니다. 치과 용 시멘트로 첫 번째 캐뉼라를 고정하십시오. 두 번째 캐뉼라의 위치 주위에 치과용 시멘트를 바르지 마십시오.
12. 치과 시멘트를 2-3 분 동안 건조 시킨 다음 첫 번째 캐뉼라에서 홀더 암을 제거하고 두 번째 캐뉼라를 고정합니다. 2.11단계와 2.12단계를 반복합니다. 양쪽 가이드 캐뉼라에 더미 캐뉼라를 놓습니다. 조직 침투와 캐뉼라의 막힘을 방지하기 위해 더미와 가이드 캐뉼라의 길이가 같은지 확인하십시오.
13. 동물의 견갑골 사이에 미리 만든 주머니에 두 카테터의 자유 끝을 삽입합니다. 클램프를 제거하고 봉합사 4-0.
    로 피부를 꿰매십시오. 메모: 상단 가이드 캐뉼러는 향후 Aβo 주입에 접근할 수 있어야 합니다.
14. 입체 프레임에서 동물을 제거하고 케이지에 다시 넣습니다. 수술 후 회복 중에는 동물이 깨어날 때까지 케이지를 따뜻한 물 담요 위에 놓습니다. 케이지는 쥐가 필요한 경우 열을 피할 수 있도록 부분적으로 패드 위에 있어야 합니다. 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 지속적으로 모니터링하십시오.
15. 쥐를 동물 시설로 돌려보내 10일 동안 면밀한 모니터링 하에 수술 후 회복합니다.
    메모: 수술을 받은 동물이 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌려보내지 마십시오. 멜록시캠(1mg/kg)은 통증 치료를 위해 수술 후 2일 동안 하루에 한 번 투여합니다.

3. 삼투압 펌프 설치

1. 설치 하루 전에 삼투압 펌프에 6E10 항체(1mg/ml, 100μl)를 채우고 멸균 조건에서 제조업체의 지침에 따라 IgG1 항체(1mg/ml, 100μl)를 제어합니다. 펌프를 37°C의 멸균 증류수에 밤새 보관하여 펌프를 작동시키십시오.
2. 쥐에게 이소플루란 3%를 마취시켜 삼투압 펌프(7일 동안 0.5μl/hr)를 설치합니다. 견갑골 사이를 면도하고 클로르헥시딘 글루코네이트 2%와 이소프로필 알코올 2% 용액으로 피부를 소독합니다. 견갑골 사이에 메스로 2cm를 절개하여 가이드 캐뉼라에 연결된 PE50 카테터를 찾습니다.
3. 치과용 시멘트가 들어 있는 PE50 카테터의 끝을 메스로 자릅니다. 삼투압 펌프를 PE50 카테터에 연결하고 펌프와 카테터 접합부에 약간의 치과용 시멘트를 추가하여 연결을 고정합니다.
4. 봉합사 4-0으로 피부를 단단히 꿰매십시오. 동물을 우리에 다시 넣고 가열수 패드에 올려 놓습니다. 동물이 이소플루란 마취에서 빠르게 깨어나는 것을 관찰합니다(약 5분).
   메모: 수술 시간은 약 5분에서 10분 정도 소요됩니다.

4. 깨어 있고 자유롭게 움직이는 쥐에 대한 Aβo 주입

1. Aβo 용액(0.2μg/μl)을 준비합니다. 주입 전에 Aβo가 실온에서 1시간 동안 역동적이고 자발적으로 응집되도록 합니다.
2. 주입 펌프에 10μl 주사기 2개를 설치합니다. 주사기에 5μl의 멸균 증류수를 채웁니다. 메스로 PE50 카테터 2개를 약 60cm 길이로 자릅니다. 1ml 주사기와 21G 바늘을 사용하여 두 카테터에 멸균 증류수를 채웁니다.
3. 1ml 주사기를 카테터의 한쪽 끝에 두고 다른 쪽 끝을 해밀턴 주사기에 연결합니다. 1ml 주사기를 제거하고 카테터 내부에 기포가 없는지 확인합니다.
4. PE50 카테터 끝에 내부 캐뉼라를 삽입합니다. 멸균 증류수를 사용하여 Hamilton 주사기에 PE50 카테터에 연결된 내부 캐뉼라를 최대 1μl까지 채웁니다. 피스톤을 최대 2μl까지 당겨 기포를 만듭니다.
5. 최소 접착 팁을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 Aβo 용액을 혼합합니다. 혼합하는 동안 기포가 생기지 않도록 하십시오. 피스톤을 최대 3.5μl까지 당겨 두 내부 캐뉼러를 1.5μl의 Aβo 용액으로 채웁니다.
6. 양쪽 카테터의 기포 전후에 마커로 선을 긋습니다. 이것은 지속적인 주입에 대한 체크포인트 역할을 합니다. 주입하려면 케이지를 주입 펌프 근처로 가져와 덮개를 제거하십시오.
7. 쥐를 껴안고 껴안은 쥐의 팔을 목에 단단히 긁어 쥐의 머리를 움직이지 못하게 합니다. 두 개의 가이드 캐뉼러에서 더미 캐뉼러를 제거합니다. 가이드 캐뉼러에 미리 준비된 내부 캐뉼러를 삽입합니다. 가이드 캐뉼러의 바닥에 완전히 삽입되고 잘 고정되었는지 확인하십시오.
8. 쥐를 껴안고 우리에 다시 넣어 다툼 스트레스를 최소화합니다. 카테터가 서로 뒤틀리지 않고 주입이 올바르게 이루어졌는지 면밀히 모니터링하십시오.
9. 주입 펌프를 켭니다. 1μl의 Aβo 용액을 0.1μl/분(10분)의 속도로 주입합니다. 주입하는 동안 주사기 피스톤이 3.5μl에서 2.5μl로 이동하고 두 PE50 카테터의 기포가 계속 움직이는지 확인합니다.
10. 주입 후 내부 캐뉼라를 5분 더 그대로 두어 Aβo 용액을 효율적으로 확산시킬 수 있습니다. 주입된 용액의 역류를 방지하기 위해 내부 캐뉼라와 뚜껑이 있는 가이드 캐뉼라를 제거하기 위해 쥐를 껴안기로 다시 가져옵니다. 캐뉼라의 앵글 암 바로 앞에서 멈추는 더미 캐뉼라를 사용하십시오. 동물을 우리로 되돌립니다.
11. 6일 연속으로 하루에 한 번씩 Aβo 주입을 반복합니다. 참수로 동물을 안락사시킵니다.

결과

그림 1. Aβo 주입 중 양측 캐뉼라가 있는 동물의 사진. 가이드 캐뉼라에 삽입된 내부 캐뉼라에 연결된 PE50 카테터를 사용하여 깨어 있고 자유롭게 움직이는 쥐(6일 동안 하루에 한 번)에 Aβo(0.2μg/μl, 1μl) 용액을 주입했습니다. 대조군(Ctl) IgG1 또는 6E10 항체를 사용한 치료는 동물의 견갑골 사이에 피하 위치한 삼투압 펌프를 사용하여 Aβo 주입 부위에 직접 주입했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인공 뇌척수액(aCSF)	하버드 기구	전화: 59-7316
PE50 카테터 얇은 벽	플라스틱 1 개	C232CT
케타민 염산염 (100 mg/mL)	바이오니쉬	1989529
자일락신 염산염 (100 mg/mL)	비메다	8XYL004C
멜록시캠(5mg/mL)	노브룩	215670I01
클로르헥시딘 글루코네이트 2%와 이소프로필 알코올 2%의 용액	케어퓨전	260100씨
리도카인 염산염	알베다 제약	0122AG01
부피바카인 하이드로클로라이드	호스피라	1559
안과 연고	Baussh 및 Lomb inc.	2125706
입체식 프레임	스톨팅	51600
입체식 캐뉼라 홀더 암	하버드 기구	전화: 72-4837
훈련	드레멜	8050-N/18
가이드 캐뉼러	플라스틱 1 개	326OPG/스pc씨
주입 캐뉼러	플라스틱 1 개	C315I/상식분리기
더미 캐뉼러	플라스틱 1 개	C315DC/스피씨
봉합사 코팅 비크릴 라피드 4-0	에티콘	VR2297
치과 아크릴 시멘트	하버드 기구	Tel.: 72-6906
나사	JI 모리스 컴퍼니	P0090CE125
6E10 항체(마우스 IgG1 isotype)	바이오레전드	803003
마우스 IgG1 isotype control 항체	아브캠	AB18447
Alzet 삼투압 펌프스 모델 1007D	듀렉트 코퍼레이션	290
이소플루란	백스터	CA2L9100
아밀로이드-베타 1-42	알펩타이드	가-1163-1
해밀턴 주사기(10μL)	피셔 사이언티크	14815279
주입 주사기 펌프 CMA 402	하버드 기구	CMA8003110
주사기 1 mL	BD (영어)	309659
바늘 21G	테루모	NN-2125R
껴안기	로미르 바이오메디컬	RTS04

년 년 명 시리즈