용량성 면역프로브 바이오센서를 사용한 표적 펩타이드 검출 및 측정

초록

출처: Kluge, N. et al., 돼지 심장에서 용량성 면역프로브에 의한 뉴로펩타이드 역학의 시간 분해 생체 내 측정.J. Vis. 특급(2022).

이 동영상은 정전식 면역프로브 바이오센서를 사용하여 펩타이드 전달체를 검출하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 항체로 코팅된 기능화된 전극은 관심 펩타이드와 상호 작용하여 펩타이드를 정밀하게 측정하고 검출할 수 있는 신호 변화를 유도합니다.

프로토콜

1. 정전식 면역프로브 제조 및 기능화

1. 25cm 길이의 PFA(perfluoroalkoxy) 코팅 백금 와이어(재료 표 참조)를 절단하고 백금 와이어가 절단되지 않도록 주의하면서 메스를 사용하여 한쪽 끝에서 약 5mm의 PFA 코팅을 벗겨냅니다.
2. 백금선의 벗겨진 끝을 금도금된 1mm 수 커넥터 핀에 삽입하고 니들 노즈 플라이어를 사용하여 백금선의 벗겨진 끝 부분에 커넥터 핀 톱니를 압착합니다(재료 표 참조).
3. 백금선을 금도금 커넥터 핀에 납땜합니다. 과도한 양의 땜납을 사용하지 않도록 주의하십시오.
4. 50mg의 도파민 HCl을 10mM 인산염 완충 식염수(PBS, pH 6.0) 50mL에 교반하여 용해하여 도파민 용액을 준비합니다.
5. 도파민이 완전히 용해되면 백금 와이어의 끝을 갓 만든 도파민이 보충된 PBS가 들어 있는 용기에 넣습니다. 금색 커넥터 핀을 헤드스테이지의 채널에 꽂습니다(재료 표 참조).
6. 염화은(AgCl) 디스크 전극(접지 전극, 재료 표 참조)을 헤드스테이지의 접지 채널에 연결합니다. 도파민이 보충된 PBS와 백금 와이어를 포함하는 용기에 AgCl 디스크를 놓습니다. 디스크 전극이 물에 잠기게 하고 와이어나 땜납의 길이가 되지 않도록 주의하십시오. 계속하기 전에 와이어 션트를 헤드의 기준 채널에 연결하십시오.tage.
7. 대화형 데이터 수집 소프트웨어를 엽니다(Table of Materials 참조). 다음 매개변수를 사용하여 톱니 전위 명령 전위 프로토콜을 준비합니다: 시작 전위 = -0.6 V; 말단 전위 = +0.65V; 스캔 속도 = 0.04V∙^s-1; 증착 기간 = 420초. 폴리도파민 증착 프로토콜을 시작하여 모든 와이어가 제대로 연결되었는지 확인합니다.
8. 폴리도파민 증착 완료 후, 혈관에서 AgCl 접지 펠릿과 백금 와이어 끝을 제거합니다., 백금 와이어 전극의 끝을 방해하지 않도록 주의. 항체 용액이 준비되는 동안 와이어 끝을 PBS(pH 7.4)가 포함된 마이크로튜브에 2-5분 동안 놓습니다. 와이어 팁이 마이크로튜브의 측면이나 바닥에 닿지 않도록 하십시오.
   참고: 항체 용액은 폴리도파민 증착 중에 만들 수 있습니다. 그러나, 폴리도파민 공술서 후에 도파민 함유 배에서 PBS의 microtube에 백금 철사의 이동은 건너뛰어서는 안 된다.
9. 항체 용액을 준비합니다. 관심 항체와 PBS(pH 7.4)를 1:20 비율로 적절한 크기의 용기(예: 마이크로튜브)에 결합합니다.
   참고: 여기에 사용된 항-뉴로펩티드 Y(항-NPY) 단클론 항체(재료 표 참조)는 1mg/mL로 분주되었습니다. 여기서 항체 제제의 예는 4μL의 항체와 76μL의 PBS입니다.
10. 백금 전극의 폴리도파민 침착 팁을 실온에서 최소 2시간 동안 항체 용액에 담그고, 백금 와이어 팁이 용액에 매달려 있고 마이크로튜브의 내부 표면에 놓이지 않는지 다시 확인합니다.
    참고: 이 기술의 최근 구현에서는 나중에 사용하기 위해 습식 또는 건식 보관 대신 이 단계 직후에 백금 와이어 전극을 사용하는 것을 선호했습니다.
11. 항체 용액에 담근 후 새로 기능화된 용량성 면역프로브(CI 프로브) 팁을 PBS(pH 7.4)로 간단히 헹굽니다. 이제 프로브를 사용할 준비가 되었습니다.

2. 펩타이드의 체외 검출 및 측정을 위한 실험 설정

1. CI 프로브의 기능 팁을 플로우 챔버에 놓고 프로브의 감각 팁이 손상될 수 있으므로 어떤 식으로든 전극 팁을 방해하지 않도록 주의하십시오.
   참고: 플로우 챔버는 접시 중앙에 길쭉한 난형 공간 필러가 있는 35mm 배양 접시에 실리콘 엘라스토머(재료 표 참조)를 부어 만들었습니다. 경화 후, 타형 모양이 엘라스토머에서 제거됩니다. 그런 다음 챔버에 Tris-buffered saline(TBS)이 과융합되고 3mL/분의 유속이 허용됩니다. 유입 및 유출이 과분산물의 조석 작용이 관찰되지 않도록 챔버의 유체 수위를 유지하는지 확인하십시오. 흐름은 CI 프로브가 사용되는 동안 제자리에 유지되어야 합니다.
2. 첫 번째 실험 테스트 전에 TBS 표준 실행을 수행하여 CI 프로브를 컨디셔닝합니다. 다음 명령 전압 프로토콜을 설정합니다: 양의 스텝 전위 = +100 mV; 음의 스텝 전위 = -5mV; 단계 지속 시간 = 20ms; 획득 기간 = 600초
   알림: 데이터 수집 전에 사이클링 명령 전위의 초기 단계에서 프로브의 평형을 허용하는 것이 중요합니다.
3. 과혼화물의 조성을 유지하기 위해 동일한 TBS를 사용하여 관심 펩타이드의 용액을 생성합니다. 튜빙 시스템 또는 플로우 챔버에 기포를 도입하지 않고 과용화물을 TBS와 펩타이드 보충 TBS 간에 전환할 수 있는 매니폴드 시스템을 설정합니다.
   참고: 합성 돼지 NPY 펩타이드(재료 표 참조)가 본 연구에서 사용되었습니다.
4. TBS 표준 매개변수를 사용하여 펩타이드 감지 데이터 수집 프로토콜을 설정합니다(2.2단계 참조).
   참고: 이 구현에서 각 실험 테스트의 지속 시간은 360초(120초 TBS, 120초 펩타이드 보충 TBS, 120초 TBS)였습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AgCl 디스크 전극	Warner Instruments (매사추세츠주 홀리스턴)	64-1307
항-NPY 단클론 항체	Abcam, (매사추세츠주 케임브리지)	AB112473
맞춤형 다중 채널 증폭기/ 1MΩ 피드백 저항기 다중 채널 헤드스테이지	NPI Electronic, (Tamm, 독일)	해당 없음	NPI VA-10M 멀티채널 앰프 기반
도파민 HCl	Sigma Aldrich (미주리주 세인트루이스)	H8502-10G
금도금 수 커넥터 핀	AMP-TE 연결(Amplimite)	재질 보기 6-66506-1
HEKA LIH 8+8 아날로그-디지털/디지털-아날로그 장치	HEKA Elektronik, (매사추세츠주 홀리스턴)	해당 없음
Igor Pro 데이터 수집 소프트웨어, v. 7.08	WaveMetrics, (레이크 오스위고, 오리건)		소프트웨어 구동 명령 잠재력 및 데이터 수집은 맞춤형으로 작성되었습니다.
Masterflex L/S 표준 디지털 연동 펌프	Cole Palmer, (일리노이주, 버논 힐스)
PFA 코팅 백금 와이어	A-M 시스템, (세큄, 워싱턴)	773000	0.005" 베어 직경, 0.008" 코팅 직경
실리콘 엘라스토머	World Precision Instruments (플로리다주 새러소타)	SYLG184
합성 돼지 NPY 펩타이드	Bachem (캘리포니아주 토런스)	4011654