해마 뉴런에서 글루타메이트 수용체 이동을 연구하기 위한 체외 기술

초록

출처: Chiu, A. M., et al. 해리된 1차 해마 배양에서 글루타메이트 수용체 이동을 연구하기 위한 항체 섭식 접근법. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 1차 해마 신경 세포에서 글루타메이트 수용체의 이동을 연구하기 위한 항체 섭식 접근 방식을 보여줍니다. 이 접근 방식을 사용하면 원형질과 내막 모두에서 수용체 집단을 관찰할 수 있습니다. 이러한 subsets 간의 구별은 동일한 1차 항체를 사용하지만 다른 형광단에 접합된 2차 항체를 사용하여 막 투과화 전후의 수용체를 라벨링함으로써 달성됩니다.

프로토콜

1. 라벨링 전 준비 사항

1. 1차 해마 배양의 준비 및 유지
   1. 폴리-D-라이신 코팅(0.1mg/mL) 18mm 커버 유리에 도금된 150,000개 세포 밀도에서 1차 해마 배양을 준비합니다. 해리된 신경 세포 배양 준비를 위한 훌륭한 가이드를 사용할 수 있습니다.
      메모: 필요한 경우, 배양액을 시토신 아라비노사이드(Ara-C, 시험관 내 1일수부터 10μM[DIV1])로 처리하여 제제 내 신경교세포 증식을 방지할 수 있습니다.
      메모: 폴리-D-라이신 대신 피브로넥틴(1mg/mL) 또는 라미닌(5μg/mL)과 같은 대체 코팅 시약을 사용할 수 있습니다.
   2. B27 및 2mM L-글루타민이 보충된 신경기저 배지의 2mL/웰에서 37°C 및 5% CO₂의 세포 배양기에서 배양을 유지합니다.
      메모: 원하는 경우 L-글루타민의 대체물(예: 글루타맥스)을 사용할 수 있습니다.
   3. 매주 배지 부피의 절반을 제거하고 동일한 부피의 보충된 neurobasal 배지로 교체하십시오.

결과

그림 1: cLTP는 GluA1의 표면 발현을 증가시킵니다. DIV21의 1차 해마 뉴런은 글리신 함유 ECS와 함께 배양하여 화학적 LTP(cLTP)를 적용했습니다. 표면 발현(빨간색) 대 세포 내(파란색) GluA1 집단의 뚜렷한 라벨링은 AMPAR의 표면 발현이 증가할 것으로 예상됩니다. (A) 단일 평면 및 (B) Z 스택(최대 강도 투영) 컨포칼 사진. 스케일 바 = 50 μm (전체 셀) 또는 5 μm (덴드라이트). 그래프는 cLTP 프로토콜 후 GluA1의 표면 발현이 증가한 것을 보여줍니다. 표면 발현 지수: 표면/세포 내 수용체(n = 3, 세포 수: con = 7, cLTP = 7, 값은 SEM± 평균을 나타냄, Mann-Whitney U .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
직경 18mm #1.5 두꺼운 커버 글라스	호중시험관	GG181.5
Alexa 555-conjugated goat 안티 마우스 2차	생명 기술	A21424 (영문
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary	생명 기술	A21429
Alexa 647-conjugated goat 안티 마우스 2차	생명 기술	A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary	생명 기술	A21245
나27	지브코	17504044
염화칼슘2	시그마	C7902
코닝 Costar 평면 바닥 세포 배양 플레이트	코 닝	3513
다이너소르	토크리스	2897
포도당	시그마	G8270
글리신	토크리스	219
염소 안티 토끼 팹 파편	시그마	SAB3700970
헤페스	시그마	H7006
케이클	시그마	P9541
L-글루타민	시그마	G7513
리포펙타민 2000	인비트로젠	11668019
마우스 anti-GluA1 항체	밀리포어	MAB2263
염화나트륨	시그마	S6546
Neurobasal 배지	지브코	21103049
NGS는	아브캠	AB7481
파라필름	베미스	오후999
PBS (PBS)	지브코	10010023
펠코 바이오웨이브	테드 펠라	36500
PFA는	알파 에자르	43368
피크로 톡신	토크리스	1128
Poly-D-lysine 하이드로 브로마이드	시그마	P7280
ProLong 골드 안티페이드 마운턴트	생명 기술	P36934
토끼 anti-GFP 항체	인비트로젠	A11122
Rabbit anti-PSD-95 항체	세포 신호 전달	2507
스트리크닌	토크리스	2785
자당	시그마	S0389
Superfrost plus 현미경 슬라이드	어부	제12-550-15
트리톤 X-100	시그마	엑스100
티엑스	토크리스	1078

) 년 년 의 (영문) 년 년 (영문) 년 년 호 년