해마 뉴런에서 글루타메이트 수용체 이동을 연구하기 위한 체외 기술

초록

출처: Chiu, A. M., et al. 해리된 1차 해마 배양에서 글루타메이트 수용체 이동을 연구하기 위한 항체 섭식 접근법. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 1차 해마 신경 세포에서 글루타메이트 수용체의 이동을 연구하기 위한 항체 섭식 접근 방식을 보여줍니다. 이 접근 방식을 사용하면 원형질과 내막 모두에서 수용체 집단을 관찰할 수 있습니다. 이러한 subsets 간의 구별은 동일한 1차 항체를 사용하지만 다른 형광단에 접합된 2차 항체를 사용하여 막 투과화 전후의 수용체를 라벨링함으로써 달성됩니다.

프로토콜

1. 라벨링 전 준비 사항

1. 1차 해마 배양의 준비 및 유지
   1. 폴리-D-라이신 코팅(0.1mg/mL) 18mm 커버 유리에 도금된 150,000개 세포 밀도에서 1차 해마 배양을 준비합니다. 해리된 신경 세포 배양 준비를 위한 훌륭한 가이드를 사용할 수 있습니다.
      메모: 필요한 경우, 배양액을 시토신 아라비노사이드(Ara-C, 시험관 내 1일수부터 10μM[DIV1])로 처리하여 제제 내 신경교세포 증식을 방지할 수 있습니다.
      메모: 폴리-D-라이신 대신 피브로넥틴(1mg/mL) 또는 라미닌(5μg/mL)과 같은 대체 코팅 시약을 사용할 수 있습니다.
   2. B27 및 2mM L-글루타민이 보충된 신경기저 배지의 2mL/웰에서 37°C 및 5% CO₂의 세포 배양기에서 배양을 유지합니다.
      메모: 원하는 경우 L-글루타민의 대체물(예: 글루타맥스)을 사용할 수 있습니다.
   3. 매주 배지 부피의 절반을 제거하고 동일한 부피의 보충된 neurobasal 배지로 교체하십시오.
2. 선택 사항: 돌연변이 및/또는 에피토프 태그 수용체의 transfection
   참고: 뉴런은 수용체 발현을 허용하기 위해 분석 시점 최소 3-4일 전에 transfection해야 합니다. 젊은 뉴런(DIV6–9)을 사용하면 오래된 뉴런(DIV15–20)보다 형질주입 효율이 더 우수하지만, 사용된 DIV에 관계없이 충분한 수의 형질주입된 세포(>20)를 달성할 수 있습니다.
   1. 12웰 플레이트의 각 웰에 대해 마이크로 원심분리기 튜브에서 B27 또는 글루타민 보충이 없는 100μL의 새로운 neurobasal 배지에 관심 구조체를 포함하는 플라스미드 1.5μg을 희석하고 빠르게 와류하여 혼합합니다.
      메모: 성공적인 transfection을 위해서는 사용된 neurobasal 배지가 가능한 한 신선해야 하며, 이상적으로는 병 개봉 후 1주일 이내에 보관하는 것이 좋습니다.
   2. 두 번째 마이크로 원심분리 튜브에서 1μL의 적절한 지방 펙션 시약을 100μL의 새로운 neurobasal 배지에 혼합하고 부드럽게 혼합합니다.
      메모: lipofection 시약 혼합물을 와류로 만들지 마십시오. 새로운 lipofection 시약을 사용하면 transfection 효율을 향상시킬 수 있습니다.
   3. 튜브를 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
   4. lipofection 시약 혼합물을 DNA 혼합물에 적가하고 부드럽게 혼합한 다음 RT에서 20분 동안 배양합니다.
   5. 각 웰의 매체 부피를 조절된 배지 1mL로 조정합니다.
   6. lipofection 시약-DNA 혼합물을 웰에 적가적으로 첨가합니다.
   7. 세포를 인큐베이터로 되돌리고 단백질 발현을 위해 최소 3-4일을 기다립니다.
      메모: 아래에 요약된 내재화 및 재활용 프로토콜의 목적을 위해, 해마 뉴런을 세포 외 도메인(GFP-GluN2B)에서 녹색 형광 단백질(GFP)로 표지된 GluN2B를 발현하는 구조체로 DIV11-12에서 형질 주입하고 DIV15-16에서 이미지화했습니다.
3. 선택 사항: 고정될 때까지 조절된 배지에서 약물(만성 또는 급성)로 세포를 배양합니다.
   참고: 급성 치료의 경우 라벨링하기 전에 세포 치료를 시작하십시오. 사용된 약물 치료 프로토콜에 따라 세포는 섹션 2 동안 약물 함유 배지에서 유지될 수 있습니다. 본 연구에서 DIV21 세포는 표면 발현 α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor(AMPAR)를 증가시키기 위해 화학적으로 유도된 장기 강화(cLTP) 프로토콜의 적용을 받았습니다.
   1. 세포외 용액(ECS)을 위한 교환 조건화된 배지.
   2. ECS에서 300μM 글리신으로 RT에서 3분 동안 세포를 처리합니다. 대조군으로, 자매 커버슬립을 ECS(글리신 없음)로 치료합니다.
   3. 37°C ECS로 셀을 3회 세척하고 ECS(글리신 제외)의 셀을 20분 동안 세포 배양기에 다시 넣은 후 섹션 2.
      를 계속 진행합니다. 참고: ECS(mM): pH 7.4에서 150 NaCl, 2 CaCl₂, 5 KCl, 10 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 30 포도당, 0.001 테트로도톡신(TTX), 0.01 스트리크닌 및 0.03 피크로톡신.

2. 표면 발현 수용체의 라이브 라벨링

1. 라벨링을 위한 커버슬립 준비
   1. 시약을 저장하고 조작을 용이하게 하려면 커버슬립 세포면을 파라핀 필름으로 덮인 트레이로 옮깁니다.
      알림: 샘플이 마르지 않도록 하는 것이 중요합니다.
   2. 배양 및 세척 단계를 위해 37°C에서 컨디셔닝된 배지를 저장하고 유지 관리합니다.
      메모: 18mm 커버슬립의 경우 항체 라벨링을 위한 75–100 μL의 배지와 내부화/재활용을 위한 120–150 μL의 배지를 사용한 배양이 권장됩니다.
2. 1차 항체를 이용한 표면 수용체의 라벨링
   1. 컨디셔닝된 배지에 희석된 1차 항체가 있는 세포를 RT.
      에서 15분 동안 배양 메모: GFP-표지된 수용체의 경우, 1:1000의 희석액에서 토끼 항-GFP 항체를 사용하였다. 내인성 GluA1의 경우 1:200 희석에서 마우스 anti-GluA1을 사용했습니다.
   2. 진공 피펫을 사용하여 항체 함유 배지를 조심스럽게 흡인하고 컨디셔닝된 배지로 세포를 세 번 세척합니다.
      메모: 컨디셔닝된 배지를 사용할 수 없는 경우 PBS+[1mM MgCl₂ 및 0.1mM CaCl₂를 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS)]를 사용하여 모든 세척 단계를 수행할 수 있습니다. 부드러운 진공 흡인을 사용할 수 없는 경우 마이크로피펫을 사용한 수동 흡인을 수행할 수 있습니다.

3. 표면 표현 (그림 1)

1. 표면 발현 수용체의 2차 항체 라벨링
   1. PBS+로 한 번 씻으십시오.
   2. PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA) 및 4% 자당으로 7-8분 동안 배양하여 세포를 고정합니다.
      메모: 메탄올 배양과 같은 다른 고정 방법과 달리 PFA는 원형질막을 투과화하지 않으므로 표면 발현 분석에 적합합니다. 최적의 결과를 얻으려면 갓 조리된 PFA를 사용하십시오. PFA를 4°C에서 단기 보관하거나 -20°C에서 장기(최대 30일) 보관하는 것이 적절한 고정을 위해 허용됩니다.
      주의: PFA는 알려진 발암 물질입니다. 취급 시 적절한 개인 보호 장비와 안전 후드를 사용하십시오.
   3. 일반 PBS로 세포를 세 번 세척합니다.
      메모: 또는 PBS 대신 0.1M 글리신을 사용하여 PFA를 세척할 수 있는데, 이는 글리신이 제제의 백그라운드를 증가시킬 수 있는 잔류 정착제를 냉각하기 때문입니다.
   4. PBS에서 10% 정상 염소 혈청(NGS)을 RT.
      에서 30분 동안 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 메모: 라벨링에 대한 부정적인 영향 없이 차단 시간을 연장할 수 있습니다.
   5. PBS에서 3% NGS로 희석된 형광 표지된 2차 항체를 RT에서 1시간 동안 배양하여 1차 항체 표지된 수용체(즉, 표면 발현)를 라벨링합니다.
      메모: 이 예시에서는 Alexa 555-conjugated secondary antibodies:goat anti-rabbit for GFP-labeled receptor와 goat anti-mouse for GluA1을 1:500 희석하여 사용했습니다.
   6. PBS 3x로 세포를 세척합니다.
2. 세포 내 수용체(intracellular receptor)의 라벨링
   1. PBS에서 0.25% Triton X-100으로 RT.
      에서 5-10분 동안 세포를 투과합니다. 메모: 항체 라벨링의 초기 라운드가 모든 표면 에피토프를 차지하는지 확인하기 위해 자매 배양에서 이 투과화 단계를 건너뛸 수 있습니다. 이 경우 세포 내 수용체에 대한 신호를 얻어서는 안 됩니다. 또한, 이전 섹션 2에서 내부 수용체가 표지되지 않았는지(즉, 배양 시 원형질막의 무결성을 보여주기 위해) 자매 배양에서는 투과화 단계를 건너뛸 수 있으며, 세포 내 단백질(예: 시냅스후 밀도 단백질 95[PSD-95] 또는 미세소관 관련 단백질 2[MAP2])에 대한 1차 항체를 2.2.1단계에서 활용할 수 있습니다. 이러한 조건에서는 이 기본 신호에서 신호를 얻어서는 안 됩니다. 이 경우, 토끼 항-PSD-95 항체(1:500)를 사용하였다.
   2. RT에서 30분 동안 PBS에서 10% NGS로 차단합니다.
   3. RT.
      에서 1시간 동안 PBS에서 3% NGS로 희석된 섹션 2.2에 사용된 것과 동일한 1차 항체로 투과화된 세포를 배양하여 세포 내 수용체를 라벨링합니다. 메모: 세포 내 수용체를 라벨링하기 위한 항체 희석은 표면 발현 수용체를 라벨링하는 데 필요한 것과 다를 수 있습니다. GluA1의 예에서는 동일한 항체 희석액(1:200)이 사용되었습니다.
   4. PBS로 세포를 3번 세척합니다.
   5. RT.
      에서 1시간 동안 PBS의 3% NGS로 희석된 두 번째 형광 표지된 2차 항체가 있는 라벨 메모: 이 예에서는 염소 안티 마우스 Alexa 647 접합 2차 항체(GluA1의 경우)를 1:500 희석하여 사용했습니다.
   6. PBS로 세포를 3번 세척합니다.

4. 내면화(그림 2)

1. 항체 표지된 표면 수용체의 내부화
   1. 표면 발현 수용체의 라벨링 및 항체 세척(섹션 2.2) 후, 항체가 없는 컨디셔닝된 배지에 세포를 유지하고 내부화를 위해 인큐베이터(37°C)로 되돌립니다.
      참고: N-methyl-D-aspartate(NMDA) 수용체의 경우 내부화를 위해 30분이 권장됩니다. 대조군으로서, 자매 배양물은 내부화 과정 동안 4°C에서 조건화된 배지로 유지될 수 있습니다. 이러한 조건에서는 최소한의 수용체 내재화가 이루어져야 한다.
2. 표면 수용체의 라벨링
   1. PBS+로 세포를 한 번 세척하십시오.
   2. PBS에서 PFA 4% 및 자당이 4%인 세포를 7-8분 동안 고정합니다.
      주의: PFA를 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비와 안전 후드를 사용하십시오.
   3. 일반 PBS로 세포를 3번 세척합니다.
   4. 비특이적 결합을 방지하기 위해 RT에서 30분 동안 PBS에서 10% NGS로 차단합니다.
   5. PBS에서 3% NGS로 희석된 형광 표지된 2차 항체로 샘플을 RT에서 1시간 동안 배양하여 1차 항체 표지 수용체(즉, 내재화되지 않은 표면 발현 수용체)를 라벨링합니다.
      메모: 이 예에서는 Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody(1:500)를 라벨링에 사용했습니다.
   6. PBS로 세포를 3번 세척합니다.
3. 내재화된 수용체의 라벨링
   1. PBS에서 0.25% Triton X-100으로 5-10분 동안 세포를 투과합니다.
   2. RT에서 30분 동안 PBS에서 10% NGS로 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다.
   3. PBS에서 3% NGS로 희석된 형광 표지된 2차 항체로 샘플을 RT에서 1시간 동안 배양하여 내부화된 항체 표지된 수용체를 라벨링합니다.
      메모: 이 예에서는 Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody(1:500)가 라벨링에 사용됩니다.
   4. PBS로 세포를 3번 세척합니다.

5. 재활용(그림 3)

1. 항체 표지된 표면 수용체의 내부화
   1. 표면 발현 수용체의 라벨링 및 항체 세척(섹션 2.2) 후, 항체가 없는 컨디셔닝된 배지에 세포를 유지하고 내부화를 위해 인큐베이터(37°C)로 되돌립니다.
      참고: NMDA 수용체의 경우 내재화를 위해 30분이 권장됩니다.
2. 안정된 표면 발현 수용체의 차단
   1. 내재화되지 않은 표면 발현 수용체에 부착된 1차 항체의 항원결정기를 차단하기 위해 RT에서 20분 동안 컨디셔닝 배지(20μg/mL)에서 희석된 접합되지 않은 Fab anti-IgG(H+L) 항체 단편(섹션 2.2에서 사용된 1차 항체 절편과 비교)으로 세포를 배양합니다. 이 치료법은 향후 2차 항체와의 상호 작용을 방지합니다.
      메모: 이 예에서는 염소 안티 토끼 Fab 조각이 사용되었습니다.
      메모: 대조 실험: 표면 발현 수용체의 완전한 차단이 발생했는지 확인하기 위해 Fab의 유무에 관계없이 자매 커버슬립을 배양할 수 있습니다. 배양액은 Fab 처리 직후에 고정되어야 하며, 두 배양액 모두 Alexa 555 접합 2차 항체로 배양됩니다. Fab-incubated 세포에서 Alexa 555 신호가 없으면 항체가 제대로 차단되지 않습니다.
   2. 컨디셔닝 배지로 셀을 3x 세척합니다.
   3. 80μM dynasore를 포함하는 컨디셔닝된 배지로 세포를 배양하여 추가 내부화를 방지하고 세포를 인큐베이터(37°C)로 되돌려 내부화된 수용체를 재활용할 수 있도록 합니다. Dynasore는 dynamin을 억제하여 내재화를 방지하는 GTPase 억제제입니다.
      알림: NMDAR 재활용의 경우 45분을 권장합니다. Dynasore는 다이나민 의존적 내재화 과정(예: NMDARs 내재화)을 독점적으로 차단합니다. 그러나 다른 시냅스 단백질(다이나민 독립성)의 내재화는 다이너소어가 있는 상태에서 여전히 발생할 수 있습니다.
3. 재활용 수용체의 라벨링
   1. PBS+로 세포를 한 번 세척하십시오.
   2. PBS에서 PFA 4% 및 자당이 4%인 세포를 7-8분 동안 고정합니다.
      주의: PFA를 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비와 안전 후드를 사용하십시오.
   3. PBS로 세포를 3번 세척합니다.
   4. 비특이적 결합을 방지하기 위해 RT에서 30분 동안 PBS에서 10% NGS로 차단합니다.
   5. RT.
      에서 1시간 동안 PBS에서 3% NGS로 희석된 첫 번째 형광 표지 2차 항체로 세포 라벨링 메모: 이 예에서는 Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit anti-rabbit anti-rabbit 항체(1:500)를 라벨링에 사용했습니다.
   6. PBS로 셀을 3번 세척합니다.
      메모: PBS로 더 오래 세척하면(5-10분) 제제의 배경을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
4. 내재화된 수용체의 라벨링
   1. PBS에서 0.25% Triton X-100으로 5-10분 동안 세포를 투과합니다.
   2. RT에서 30분 동안 PBS에서 10% NGS로 차단합니다.
   3. RT.
      에서 1시간 동안 PBS의 3% NGS로 희석된 두 번째 형광 표지된 2차 항체가 있는 라벨 메모: 이 예에서는 Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit anti-rabbit anti-rabbit antibody(1:500)를 라벨링에 사용했습니다.
   4. PBS로 세포를 3번 세척합니다.

6. 샘플의 장착 및 이미징

1. 커버슬립 셀 쪽을 아래로 향하게 하여 적절한 장착 매체의 12–15 μL에 부드럽게 셀을 장착합니다.
   메모: 과도한 마운팅 미디어를 흡입하면 이미지 품질이 향상됩니다.
2. 적절한 컨포칼 현미경의 이미지 셀.
   메모: 뉴런의 전체 두께를 포함하는 0.35μm 단계로 60배 배율로 z-스택을 이미지화하는 것이 좋습니다.

7. 시간 고려 사항

1. 이것은 여러 지점에서 중지할 수 있는 긴 프로토콜입니다. 원하는 경우 습한 챔버에서 4°C에서 밤새 차단 및 1차 항체 배양 단계를 수행합니다.
2. 또는 원하는 경우 마이크로파 조직 처리기를 사용하여 고정 후 배양 시간을 크게 단축할 수 있습니다. 모든 단계에서 "켜기" 설정을 위해 150°C에서 30W를 사용합니다.​
   1. 차단하려면 프로세서를 2분 "켜기", 1분 "끄기" 및 2분 "켜기"에서 실행합니다.
   2. 1차 및 2차 항체 배양 단계의 경우 프로세서를 3분 "켜기", 2분 "끄기" 및 3분 "켜기"에서 실행합니다.
      참고: 우리는 프로토콜에 대한 위의 변경을 통해 품질에 차이를 관찰하지 못했습니다.

8. 이미지 분석

1. FIJI 는 여러 파일 형식과 호환되므로 이미지 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 이 데이터의 경우 Nikon ND2 파일 형식의 이미지를 획득했습니다.
2. FIJI에서 미리 선택한 다양한 매개변수의 배치 정량화를 쉽게 할 수 있도록 매크로 스크립트가 제공됩니다. 매크로에는 다음 단계가 포함되어 있습니다.
   참고: 이 예에서는 "통합 강도"가 측정되었습니다.
3. FIJI와 별도의 채널에서 이미지 파일을 엽니다.
4. 각 채널 스택을 최대 강도 투영으로 Z-투영합니다.
5. 각 채널에 대해 더 낮은 임계값을 설정합니다.
   참고: 임계값은 각 실험 데이터 세트에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 각 채널은 별도의 낮은 임계값을 가질 수 있지만 동일한 데이터 세트의 모든 이미지에 대해 채널 임계값이 일관되게 유지되는 것이 중요합니다.
6. 3-5개의 2차 또는 3차 수상돌기를 선택하여 관심 영역(ROI)으로 저장합니다.
7. 표면 및 세포 내 채널에서 각 ROI의 통합 밀도를 측정합니다.
8. 표면 채널의 적분 밀도 값을 세포 내 채널로 나누어 각 ROI에 대한 신호를 정규화합니다.
9. 모든 대조군 및 실험 이미지에 대해 측정을 반복하고 실험 값을 대조 값(예: GluN2B WT 또는 무글리신 조건)으로 정규화합니다.

결과

그림 1: cLTP는 GluA1의 표면 발현을 증가시킵니다. DIV21의 1차 해마 뉴런은 글리신 함유 ECS와 함께 배양하여 화학적 LTP(cLTP)를 적용했습니다. 표면 발현(빨간색) 대 세포 내(파란색) GluA1 집단의 뚜렷한 라벨링은 AMPAR의 표면 발현이 증가할 것으로 예상됩니다. (A) 단일 평면 및 (B) Z 스택(최대 강도 투영) 컨포칼 사진. 스케일 바 = 50 μm (전체 셀) 또는 5 μm (덴드라이트). 그래프는 cLTP 프로토콜 후 GluA1의 표면 발현이 증가한 것을 보여줍니다. 표면 발현 지수: 표면/세포 내 수용체(n = 3, 세포 수: con = 7, cLTP = 7, 값은 SEM± 평균을 나타냄, Mann-Whitney U ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
직경 18mm #1.5 두꺼운 커버 글라스	호중시험관	GG181.5
Alexa 555-conjugated goat 안티 마우스 2차	생명 기술	A21424 (영문
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary	생명 기술	A21429
Alexa 647-conjugated goat 안티 마우스 2차	생명 기술	A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary	생명 기술	A21245
나27	지브코	17504044
염화칼슘2	시그마	C7902
코닝 Costar 평면 바닥 세포 배양 플레이트	코 닝	3513
다이너소르	토크리스	2897
포도당	시그마	G8270
글리신	토크리스	219
염소 안티 토끼 팹 파편	시그마	SAB3700970
헤페스	시그마	H7006
케이클	시그마	P9541
L-글루타민	시그마	G7513
리포펙타민 2000	인비트로젠	11668019
마우스 anti-GluA1 항체	밀리포어	MAB2263
염화나트륨	시그마	S6546
Neurobasal 배지	지브코	21103049
NGS는	아브캠	AB7481
파라필름	베미스	오후999
PBS (PBS)	지브코	10010023
펠코 바이오웨이브	테드 펠라	36500
PFA는	알파 에자르	43368
피크로 톡신	토크리스	1128
Poly-D-lysine 하이드로 브로마이드	시그마	P7280
ProLong 골드 안티페이드 마운턴트	생명 기술	P36934
토끼 anti-GFP 항체	인비트로젠	A11122
Rabbit anti-PSD-95 항체	세포 신호 전달	2507
스트리크닌	토크리스	2785
자당	시그마	S0389
Superfrost plus 현미경 슬라이드	어부	제12-550-15
트리톤 X-100	시그마	엑스100
티엑스	토크리스	1078

) 년 년 의 (영문) 년 년 (영문) 년 년 호 년