검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 대상 마이크로스피어 준비
- 관련 표적 항원을 선택합니다.
메모: 이 예에서는 재조합 단백질 V1V2-2F5K를 사용했는데, 이는 천연 HIV 외피의 삼중 정점을 모방하도록 설계되었습니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트(Table of Materials)를 사용하여 비오틴화(biotinylation)를 수행합니다.
- 다음 공식을 사용하여 5배 몰 초과량에 대한 반응에 추가할 비오틴 시약의 mmol을 계산합니다: mmol 비오틴 = mL 단백질 x (mg 단백질/mL 단백질) x (mmol 비오틴/mg 단백질) x (5mmol 비오틴/mmol 단백질). 그런 다음 다음 공식을 사용하여 추가할 비오틴 시약의 μL를 계산합니다: μL 비오틴 = mmol 비오틴 x (1,000,000 μL/L) x (L/10 mmol).
- 개봉하기 전에 비오틴을 실온으로 평형을 이루십시오. 위의 계산에 따라 0.5-2.0mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 단백질을 용해합니다.
- 디메틸설폭사이드(DMSO)에서 10mM 비오틴 시약 용액을 준비하고 단백질 용액에 적절한 부피의 10mM 비오틴 시약을 첨가하고 얼음 위에서 2시간 또는 실온에서 30분 동안 반응을 배양합니다.
- 단백질 농축기(폴리에테르설폰[PES] 멤브레인, 3kDa 분자량 컷오프[MWCO], 0.5mL)를 사용하여 과도한 비오틴을 제거합니다. 재료 표) 제조업체의 지침에 따라.
- 스핀 컬럼의 상부 챔버에 시료를 증착하고 최대 400μL의 PBS를 첨가한 다음 이 시료 챔버를 수집 튜브에 삽입합니다. 12,000 x g의 원심분리기를 실온에서 30분 동안 사용합니다.
- 플로우 스루(flow through)를 버리고 PBS를 400 μL에 첨가합니다. 원심분리를 반복합니다. 플로우 스루(flow-through)를 버리고 PBS를 100 μL에 첨가합니다. 분광 광도계로 단백질 농도를 측정합니다.
메모: 단백질은 분주하여 사용할 때까지 -80°C에서 동결할 수 있습니다.
2. 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP) 분석 플레이트 준비
- 비오틴화된 단백질을 1μm 마이크로스피어('비드'; 재료 표) 제조업체의 지침에 따라.
- 접합 비드 플레이트당 200μL의 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)-PBS에 6μG의 단백질과 12μL의 스톡 비드를 실온에서 1시간 동안 배양하고 20분마다 부드럽게 와류로 배양합니다.
- 13,000 x g에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 버리고 부드럽게 와류를 일으킨 다음 1200μL의 0.1% BSA-PBS에 재현탁합니다. 탈수 및 세척 2x 단계를 반복합니다. 1200 μL의 0.1% BSA-PBS에서 재현탁합니다.
- 둥근 바닥 96웰 플레이트에 웰당 10μL의 비드 용액을 분취합니다. 일반적으로 50μg/mL의 항체 또는 1/100 혈청 희석에서 시작하여 12μL의 2% HSA HBSS에 관심 항체 또는 면역 혈청의 희석액을 준비합니다.
메모: 샘플 데이터에서는 단클론 항체(mAb) 830A를 사용했습니다.
- 비드 플레이트에 10μL의 적정 항체/혈청을 추가하고 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.200μL의 2% HSA HBSS를 각 웰에 추가하고 2,000 x g에서 10분 동안 원심분리 플레이트를 추가합니다.
- 보이지 않는 비드 펠릿을 방해하지 않도록 플레이트 웰에서 싱크대로 액체를 빠르게 뒤집고 디캔팅하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
3. 모유 세포 분리
- 건강한 수유 중인 여성으로부터 이중 전자 또는 수동 펌프를 사용하여 표현되는 인간 모유를 얻습니다. 발현 후 ~4시간 이내에 세포를 분리하고 우유를 실온에 유지합니다.
- 50mL 튜브를 사용하여 50mL 우유를 800 x g에서 15분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 방해받지 않고 탈지유와 지방을 조심스럽게 붓습니다. 보푸라기가 없는 천으로 튜브 내부를 닦아 튜브 벽의 모든 지방을 제거합니다.
- Hank's balanced salt 용액(2% HSA HBSS[Ca2+ 또는 Mg+ 제외])에 2% 인간 혈청 알부민 10mL를 추가합니다. 세포 활성화와 세포사멸을 피하기 위해 부드러운 피펫팅으로 펠릿을 재현탁합니다. 15mL 튜브로 옮기고 450 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 붓고 1.3단계를 반복합니다. 그런 다음 예상 세포 수에 따라 1-2mL의 2% HSA HBSS에 세포를 부드럽게 재현탁하고 혈구계 또는 자동 세포 계수기로 세포 계수를 계산하면서 세포 생존력도 확인합니다.
4. ADCP 분석
참고 : 여기에 설명 된 방법은 Ackerman et al
.
- 200μL의 2% HSA-HBSS에서 각 ADCP 분석 플레이트 웰에 새로 분리된 50,000개의 BM 세포를 추가합니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
- 대조군 실험의 경우, 플레이트에 추가하기 전에 10μg/mL 액틴 억제제(cytochalasin-D), 50μg/mL Fc 수용체 차단제(FcBlock) 또는 이 둘의 조합으로 37°C에서 세포를 사전 배양합니다.
- 930 x g에서 10분 동안 원심분리기 플레이트. 200μL의 2% HSA HBSS를 첨가하고 원심분리를 반복합니다. 2.7단계와 같이 상층액을 조심스럽게 제거하고 세척을 반복합니다.
- 50μL의 2% HSA HBSS에서 웰당 0.5μg/mL(최종 농도)의 고정성 생존도 stain 450을 사용하여 생존도를 위해 상층액 및 염색 세포를 조심스럽게 제거합니다. 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 배양합니다. 930 x g에서 10분 동안 원심분리기 플레이트를 만들고 2.7단계와 같이 상층액을 제거합니다. 200μL의 2% HSA HBSS와 원심분리 플레이트를 다시 추가한 후 2.7단계와 같이 상층액을 제거합니다.
- 생존능 염색 후, 최적화된 농도(예시 데이터에서 1% BSA HBSS의 50μL 중 1μg/μL)에서 PE-마우스 항인간 CD45(클론 HI30)와 같은 CD45 특이적 염색을 최소한으로 포함하여 관심 있는 백혈구 마커에 대한 염색 세포를 염색합니다.
메모: 관심 있는 모든 계보별 마커를 포함할 수 있습니다.
- 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 배양합니다. 930 x g에서 10분 동안 원심분리기 플레이트를 만들고 2.7단계와 같이 상층액을 제거합니다. 200μL의 1% BSA HBSS를 첨가하고 원심분리를 반복합니다. 상등액을 제거합니다. 0.5% 포름알데히드 200μL의 세포를 실온에서 30분 동안 또는 4°C에서 밤새 암흑 속에서 고정합니다. 분석할 때까지 어둠 속에서 냉장 보관합니다.
5. 유세포 분석에 의한 분석
- 전방 산란(FSC) 대 측면 산란(SSC) 플롯 및 파편(FSC = 5000보다 작은 재료)에서 이중선을 제거하기 위해 초기 게이팅을 수행합니다(그림 1 참조). SSC 대 생존도 염색(이 경우 V450) 플롯을 사용하여 죽은 세포(생존도 염색에 양성인 세포)를 제거합니다.
- SSC 대 CD45 플롯을 사용하여 광범위하게 설명된 대로 주요 백혈구 분류(과립구, 단핵구, 림프구)를 구별합니다.
메모: 이 분류는 암시적일 뿐이며 세포 유형을 확인하기 위해 계통별 마커가 필요합니다.
- 모든 CD45+ 세포 또는 관심 있는 각 백혈구 하위 집합에 대해 형광 비드가 검출되는 FITC(fluorescein isothiocyanate) 채널의 히스토그램에서 비드 양성 세포의 마커로 게이팅하여 ADCP 활성을 측정합니다.
메모: 비드가 추가되지 않은 negative control well은 bead-positive cell이 히스토그램에서 뚜렷하게 나타나는 위치와 게이팅 마커를 배치할 위치를 나타냅니다.
- ADCP 점수를 (비드 양성 세포의 중앙값 형광 강도[MFI]) x (총 CD45 + 양성 모집단의 세포의 %)로 계산합니다. 그래픽 소프트웨어를 사용하여 각 Ab/혈청 농도의 점수를 플롯하고 AUC(Area-Under-the-Curve) 분석을 수행합니다.
메모: ADCP는 AUC가 비특이적 음성 대조군 mAb(이 경우 3865)의 ADCP 점수 AUC의 3배 표준 편차보다 큰 경우 양수로 간주됩니다.
