동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 쥐의 비장에서 면역 세포의 준비
참고: 이산화탄소(CO2) 안락사로 순진한 쥐를 안락사시킵니다. Jackson Laboratories에서 구입하여 사육한 C57BL/6 마우스는 생후 6-12주에 실험에 사용됩니다. 수컷과 암컷 마우스 모두 실험에 사용됩니다.
- 외부 오염 물질이 샘플에 유입될 가능성을 줄이기 위해 70% 에탄올로 마우스 피부를 소독합니다.
- 해부 도구, 수술용 가위 및 집게를 사용하여 쥐의 비장을 해부합니다. 비장을 적출하고 분리된 비장을 얼음 위에 ~5mL의 완전한 Roswell Park Memorial Institute 배지(cRPMI)가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
메모: 완전 RPMI는 10%의 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 1%의 페니실린/스트렙토마이신으로 구성됩니다.
- 쥐의 비장을 채취하려면 쥐의 왼쪽을 따라 앞다리와 뒷다리의 중간쯤 되는 털과 피부를 가위로 5cm 정도 절개합니다. 체강을 ~ 5cm 열고 집게를 사용하여 비장을 제거하십시오. 비장은 강낭콩 색깔이며 이웃 신장보다 길고 평평합니다.
- 1.2단계의 내용물을 새 50mL 원뿔형 튜브에 부착된 멸균 70μm 필터에 붓습니다. 필터 표면에 비장 펄프가 남지 않을 때까지 5mL 주사기 플런저로 필터를 통해 비장을 밀어 비장을 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 분리합니다.
- 스윙 아웃 로터 조리대 원심 분리기를 사용하여 500 x g에서 4 ° C에서 5 분 동안 비장 세포를 펠렛 링합니다.
- 상등액을 조심스럽게 디캔팅하십시오. 펠렛화된 비장 세포는 50mL 원뿔형 튜브의 바닥에 남아 있습니다.
- 적혈구를 제거하려면 제조업체의 지침에 따라 1mL의 암모늄-염화물-칼륨(ACK) 용해 완충액에 펠릿화된 비장 세포를 3분 동안 다시 현탁시킵니다. 잘 섞는다.
- ACK 용해 완충액을 15mL의 cRPMI로 퀀칭합니다.
- 1.4단계의 지시에 따라 림프구를 펠렛화합니다.
- 50mL 코니컬 튜브에서 5mL의 cRPMI로 세포 현탁액을 다시 현탁합니다. 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
- 세포를 계수하려면 세포 현탁액 10μL를 0.6mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 Trypan blue 용액으로 1:1 비율로 희석합니다. 그런 다음 혈구계 또는 자동 세포 계수 시스템으로 옮깁니다.
- 계수 후, 단계 1.9와 같이 세포 현탁액의 세포 농도에 따라 4°C에서 500 x g의 탁상용 원심분리기에서 5분 동안 세포를 펠렛화하여 Indo-1 AM 에스테르 염료를 포함하는 cRMPI 배지를 첨가할 준비를 합니다.
- 10-12 x 106 cells/mL를 달성하기 위해 세포의 재현탁액을 위한 부피를 계산합니다. 이는 필요한 총 세포 수의 2배 농도입니다.
- 1.11단계에서 계산된 cRPMI 부피의 셀을 다시 현탁합니다. 뚜껑이 통기되는 50mL 원추형 튜브 또는 조직 배양 플레이트에 5% CO2가 포함된 37°C의 세포를 놓습니다.
2. Indo-1 비율계량 염료 및 형광 항체 라벨링
- 제조업체의 지침에 따라 50μg의 Indo-1 AM이 들어 있는 바이알에 50μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 추가합니다. 원액의 농도는 1 μg/μL.
입니다.
메모: DMSO는 DMSO의 산화를 방지하기 위해 키트와 함께 마이크로 바이알로 제공됩니다.
- 스톡 분취액(1 μg/μL)을 2배 농도인 6 μg/mL의 농도로 cRPMI의 적절한 실험 부피(1.11에서 설정)로 희석합니다. Indo-1을 수용액에 보관하지 마십시오.
메모: 칼슘이 첨가된 다른 완충제는 세포의 필요에 따라 사용할 수 있습니다.
- Indo-1이 포함된 전체 배지를 37°C의 수조에 따로 보관하십시오.
메모: 적절한 신호를 얻는 데 필요한 최소 농도의 Indo-1 AM 에스테르를 사용하십시오. 이것은 다양한 세포 유형에 대해 적정되어야 합니다. 일반적으로 3-5μM 사이의 농도로 충분합니다. 일차 T 세포의 경우, >5 μg/mL 농도의 Indo-1 세포를 로딩하면 스펙트럼 유세포 분석기에서 평균 형광 강도(MFI)가 log 6 이상으로 증가합니다. 이 경우 자외선(UV) 레이저 강도를 낮추고 Indo-1을 더 낮은 농도로 적정하십시오.
- 2.2단계에서 만든 2x Indo-1 배지를 포함하여 이전에 준비된 세포 현탁액(1.12단계)을 cRPMI에 1:1로 희석합니다. 세포의 농도가 5-6 x 106/mL.
인지 확인합니다.
메모: 염색되지 않은 단일 염색 제어 또는 표면 마커 단일 염색 세포 대조군을 Indo-1로 염색하지 마십시오. 단일 염색 항체 대조군에 Indo-1을 추가하면 단일 염색 세포에 Indo-1이 추가되어 다중 색상 샘플이 생성됩니다. 2.6단계에서 생성된 샘플 플레이트에 인도-1(칼슘 없음) 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA)을 추가합니다.
- 1mL의 세포/웰/실험 조건을 12웰 조직 배양 플레이트에 추가합니다.
- 이전에 Indo-1 염료가 적재된 세포를 사용하여 Indo-1(칼슘 없음) 샘플에 대한 단일 염색 대조군을 만들고 EGTA를 최종 농도 2mM에 추가합니다. EGTA는 세포 현탁액에서 칼슘을 킬레이트화하여 더 깨끗한 대조군 샘플을 제공합니다.
- 유세포분석기에서 염료가 주입된 세포 현탁액에 50μM의 ionomycin을 추가하여 Indo-1 positive control(Indo-1 칼슘 결합)을 생성합니다. 아이오노마이신(Ionomycin)은 칼슘 이온을 결합하고 칼슘 이온이 세포로 전달되는 것을 촉진하는 멤브레인 투과성 칼슘 이오노포어입니다.
- 형광단 또는 Indo-1 염료가 없는 생물학적 음성 제어를 위한 웰을 만듭니다.
- 유세포 분석 패널 설계에서 항체 접합 형광단을 사용하여 추가 관심 세포 집단(항체 사용자 정의)에 대한 단일 염색 제어를 위한 웰을 생성합니다. 여기에는 Indo-1 비율계량 염료가 포함되지 않습니다.
- 표면 염색을 위해 형광 접합 항체를 추가하기 전에 제조업체의 지침에 따라 Fc 수용체 차단 항체(~2 μg/1 x 106 세포)를 추가합니다.
- 플레이트를 37 ° C에서 45 % CO 2로 5 분 동안 배양합니다.
- 15분마다 플레이트를 부드럽게 두드려 12웰 플레이트에 세포를 다시 부유시킵니다.
- 12-well 플레이트에서 배지에 부유하는 세포의 전체 부피를 혼합하고 제거합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다.
- 실온에서 500 x g의 마이크로 원심분리기로 세포를 5분 동안 펠렛화합니다. 상층액을 디캔팅하고 예열된 cRPMI 1mL를 첨가하여 세포를 세척합니다. 다시 펠릿하고 상층액을 디캔팅합니다.
메모: 세포를 세척하면 남아 있는 Fc 차단 항체가 제거됩니다.
- 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 1mL의 cRPMI로 세포를 재현탁하고 각 튜브를 37°C에서 5% CO2로 30분 더 배양한 후 튜브 상단을 약간 열어 가스 교환을 허용합니다. 이를 통해 세포 내 AM 에스테르의 완전한 탈에스테르화가 가능합니다.
- 필요한 경우 세포를 12웰 조직 배양 플레이트로 다시 옮깁니다. 휴지 단계에서 추가 사용자 정의 적정 플루오로크롬 접합 항체를 추가할 수 있습니다.
메모: 방법 패널에서 사용되는 마커에는 Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 및 CD1d/α-galcer tetramer가 포함됩니다. T 세포 subset을 분석하기 위해 marker가 선택됩니다.
- 관심 세포 유형에 따라 이전에 적정된 부피로 모든 사용자 정의 형광색소 접합 항체의 마스터 믹스를 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 생성합니다.
- 휴지 세포에 대한 적정 항체에 따라 세포 부피의 1mL에 대해 계산된 마스터 믹스를 추가합니다.
메모: 이후 단계 2.18 대신 단계 2.15에서 염색의 장점은 단계 2.15에서 염색하면 실험의 전체 배양 시간이 단축된다는 것입니다. 그러나 2.15단계에서 총 부피 1mL로 염색하면 항체 사용량이 증가합니다.
- 휴식 후 실온에서 500 x g에서 5분 동안 셀을 펠릿화합니다.
메모: 12-well 조직 배양 플레이트의 세포는 플레이트 원심분리기 액세서리를 사용하여 플레이트에서 펠릿화할 수 있습니다. 그렇지 않으면 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 세포를 펠릿화합니다.
- 1mL의 4°C 차가운 cRPMI에 펠릿을 재현탁하여 세포를 세척하고 2.16단계와 같이 세포를 다시 펠릿화합니다. 얼음 위에 셀을 놓습니다.
메모: 세포를 개별적으로 표면 염색하는 경우 2.18단계에서 탈에스테르화 후 더 적은 항체 부피가 필요합니다. 이 단계에서 표면 염색은 저온 유동 완충액(1% FBS가 첨가된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 1개)에서 휴지 단계 후 사용자 정의 항체를 사용하여 얼음 위에서 30분 동안 수행할 수 있습니다. 2.17단계와 같이 cRPMI에서 염색 후 세포를 세척합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 DPBS로 1:7,500으로 희석된 생존도 염색 Ghost540을 샘플에 추가합니다. 열은 단일 염색된 살아있는/죽은 제어를 위해 55°C에서 온난화 블록에서 세포를 죽입니다.
메모: 유세포 분석에서 죽은 세포를 제거하기 위한 생존력, 기능성 염료 염색은 FBS 없이 수행됩니다. FBS는 제조업체의 지침에 따라 아민 염료와 상호 작용할 수 있습니다.
- 캡이 있는 5mL 폴리스티렌 플로우 튜브를 사용하여 500μL의 cRPMI(페놀 레드 프리)에 개별 샘플을 다시 현탁합니다.
메모: 세포는 최대 한 시간 동안 4°C에서 방치할 수 있습니다.
- 유세포분석기에서 분석하기 전에 7분 동안 비드 수조를 사용하여 세포가 들어있는 모든 5mL 튜브를 개별적으로 37°C로 가열하여 샘플 간 시간을 일정하게 유지합니다. 타이머를 사용합니다.
3. 비드 수조 튜브: 칼슘 플럭스 분석 중 온도 유지
- 물을 넣지 않은 작은 수조에 목욕 구슬을 넣고 37°C까지 예열합니다.
- 면도날로 50mL 원뿔형 튜브를 25mL 표시에서 조심스럽게 반으로 자르고 튜브 상단을 버립니다.
- 반으로 자른 튜브의 3/4을 목욕 구슬로 채웁니다.
- 3.2단계에서 만든 튜브를 3.1단계에서 만든 비드 수조에 넣습니다. 튜브와 비드를 37°C로 가져옵니다.
- 시료 분석을 준비하기 위해 온도를 유지하기 위해 비드 수조를 유세포 분석기 옆의 전기 콘센트에 꽂습니다.
- 50mL 원뿔형 스티로폼 랙 컷을 추가하여 유세포 분석기에서 작동하는 동안 튜브를 제자리에 배치하기 위해 하나의 튜브를 고정합니다. 이렇게 하면 곡선 분석 기간 동안 튜브를 수동으로 잡을 필요가 없습니다.
