인간 노로바이러스 VLP와 장내 세균의 결합을 정량화하기 위한 분석

초록

출처: Madrigal, J. L., et al. 유세포 분석을 사용하여 공생 박테리아에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스 유사 입자 정량화. J. Vis. 특급 (2020).

이 동영상은 인간 장내 세균에 결합하는 인간 노로바이러스 유사 입자(VLP)를 정량화하기 위한 분석을 보여줍니다. 박테리아 현탁액은 VLP와 혼합되고 배양되어 VLP-박테리아 복합체가 형성될 수 있도록 합니다. 그런 다음 복합체를 형광단 태그가 지정된 VLP 특이적 항체로 라벨링한 다음 유세포 분석 기반 시각화 및 정량화를 통해 VLP 결합 박테리아의 비율을 식별합니다.

프로토콜

1. VLP-박테리아 부착 분석

주의: 인간 노로바이러스 VLP는 생물안전성 수준(BSL)-2 위험이며 VLP와 관련된 모든 작업은 생물 안전성 캐비닛에서 수행해야 합니다. 부착 분석 전에 박테리아 배양의 준비는 유기체에 적합한 안전 조건을 사용하여 수행해야 합니다.

1. 시약 준비
   1. 인산염 완충 식염수(PBS) 1개
      1. 10L 탈이온수(DI) 1L에 패킷을 용해시켜 10x PBS 1L를 준비합니다.
      2. 30분 동안 오토클레이브 솔루션
      3. 위의 용액을 DI 물에 1:10으로 희석하여 1x 용액을 준비합니다.
      4. 필터는 용액을 0.22μm 필터에 통과시켜 실온에서 보관하여 살균합니다.
   2. 5% BSA
      1. PBS 100mL에 소 혈청 알부민(BSA) 분말 5g을 첨가하여 5%(w/v) 용액을 생성합니다.
      2. 덩어리가 녹을 때까지 교반 플레이트에서 볼텍싱하거나 금속 교반 막대를 사용하여 용액을 혼합합니다.
      3. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다.
      4. 용액을 4°C에서 보관하십시오.
   3. 유세포 분석 염색 완충액(FCSB)
      1. 구매한 FCSB(재료 표 참조)를 0.22μm 필터를 통해 필터링합니다.
      2. 남은 용액은 4°C에서 보관하십시오.
   4. 5% 블로킹 버퍼(BB)
      메모: 매번 신선하게 준비하십시오.
      1. 멸균 FCSB 10mL에 BSA 0.5g을 추가합니다.
      2. Vortex는 샘플을 철저히 혼합하고 사용할 때까지 얼음에 남겨 둡니다.
2. 항체 접합
   1. 제조업체의 지침에 따라 R-PE 항체 라벨링 키트를 사용하여 인간 노로바이러스 GII 항체(Table of Materials)를 r-phycoerythrin(PE)과 접합합니다(Table of Materials(재료표 참조).
   2. 향후 VLP-박테리아 부착 분석 분석에 사용할 수 있도록 접합 항체를 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오.
      메모: VLP-박테리아 부착 분석에 사용하기 전에 1차 항체를 적정하여 유세포 분석에 필요한 적절한 농도를 결정해야 합니다. 항체 적정은 접합 반응이 수행될 때마다 그리고 부착 분석에 사용된 각 박테리아에 대해 수행되어야 합니다.
3. 항체 적정
   1. 접합된 항인간 노로바이러스 GII 항체를 시작 희석 1:100 및 종료 희석 1:600(총 6회 희석)으로 100배 희석합니다.
   2. 다음과 같은 예외를 제외하고 아래 설명된 대로 바이러스 부착 분석을 수행합니다: 1.5.7단계에서 박테리아 펠릿을 350μL의 5% BB에 재현탁합니다.
   3. 샘플을 7개의 50μL 분취량으로 나눕니다.
   4. 각 항체 희석액 50μL를 튜브 하나에 추가합니다.
   5. 5% BB 50μL를 염색되지 않은 대조군으로 7번째 튜브에 추가합니다.
   6. 아래 설명된 대로 모든 샘플에 대해 유세포 분석을 수행합니다.
   7. 희석된 항체 샘플을 염색되지 않은 대조군과 비교하고 서로 비교합니다. 양성 신호의 감소 또는 손실을 초래하지 않는 가장 낮은 항체 농도는 후속 분석을 위해 선택해야 합니다.
4. 박테리아의 준비
   1. 박테리아가 고정상이 될 때까지 적절한 대기 조건에서 40mL의 적절한 액체 배지에서 박테리아를 성장시킵니다.
      1. 엔테로박터 클로아카에 배양물을 37°C의 루리아 브로스에서 하룻밤 동안 호기적으로 배양하고 200rpm으로 흔들어 고정상에 도달합니다.
      2. De Man, Rogosa 및 Sharpe(MRS) 육수에서 Lactobacillus gasseri 배양을 37°C로 설정된 수조에서 18시간 동안 흔들지 않고 검은색 스크류 캡 튜브에 담아 고정상에 도달하도록 합니다.
   2. 고정상 배양을 옮겨 2,288 x g에서 10분 동안 50mL 코니컬 튜브와 원심분리 시료를 세척하여 박테리아를 펠릿화합니다.
   3. 상층액을 제거하고 13mL의 멸균 1x PBS에 재현탁합니다. 이 세탁 단계를 반복하여 총 두 번 세탁합니다.
   4. 샘플을 다시 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 20mL의 1x PBS.
      에 샘플을 재현탁합니다. 메모: 세포 펠릿이 작으면 재현탁 부피를 줄일 수 있습니다.
   5. 배양의 OD₆₀₀을 측정합니다.
   6. 표준 곡선을 사용하여 세척된 배양물의 mL당 집락 형성 단위(CFU)를 측정합니다.
   7. 박테리아를 1x PBS로 희석하여 배양 농도를 1 x 10⁸ CFU/mL로 조정합니다.
   8. 1 x 10⁸ CFU/mL 박테리아 배양 1mL를 필요한 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   9. 튜브를 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
   10. 박테리아 펠릿을 1mL의 멸균 5% BSA에 재현탁합니다.
   11. 일정한 회전으로 37°C에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다.
5. 바이러스 부착
   1. BSL-2 생물 안전성 캐비닛 내부에서 PBS에 재현탁된 박테리아가 들어 있는 각 튜브에 10μg의 인간 노로바이러스(HuNoV) VLP(재료 표 참조)를 추가하고 피펫팅으로 철저히 혼합합니다.
      메모: VLP 농도는 각 VLP 제제에 따라 다릅니다. 따라서 박테리아에 추가되는 부피는 준비 배치마다 다르며 실험에서 각 튜브에 10μg이 추가되도록 적절하게 조정해야 합니다. 박테리아 전용 대조군(예: VLP가 없는 샘플)의 경우 실험 샘플에 추가된 VLP의 부피와 동일한 PBS 부피를 추가합니다.
   2. 일정한 회전으로 37°C에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다.
      참고: 40rpm으로 설정된 튜브 리볼버(재료 표 참조)는 배양 중에 사용됩니다.
   3. 배양 후 10,000 x g에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다.
   4. 상등액을 버리고 박테리아 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁합니다.
   5. 세척 단계 1.5.3 및 1.5.4를 반복합니다.
   6. 10,000 x g에서 5분 동안 시료를 원심분리합니다.
   7. 상등액을 버리고 박테리아 펠릿을 150μL의 5% BB에 재현탁합니다.
6. 항체 염색
   1. 신선한 5% BB.
      를 준비합니다. 참고: 형광 표지 항체를 사용하는 모든 작업은 어두운 곳에서 수행해야 하며 항체, BB 및 FCSB는 얼음 위에 보관해야 합니다.
   2. E. cloacae 샘플의 경우 human norovirus GII 항체 1:125, L. gasseri 샘플의 경우 1:150을 5% BB에 희석하여 샘플당 50μL의 희석 항체를 준비합니다.
   3. 인간 노로바이러스 GII 항체를 각 박테리아에 대해 5% BB로 희석한 것과 동일한 방식으로 동형항체를 희석하여 시료당 50μL의 희석된 동형항체를 준비합니다.
   4. 1.3.7단계의 각 부착 분석 샘플을 깨끗한 1.5mL 원심분리 튜브로 옮겨 50μL 부분 표본 3개로 나눕니다.
   5. 첫 번째 샘플 세트에 BB 50μL를 추가합니다. 이 세트는 염색되지 않은(Uns) 컨트롤이 됩니다.
   6. 두 번째 세트에 GII 항체 희석 50μL를 추가합니다. 그 결과 최종 항체 농도는 E. cloacae의 경우 1:250, L. gasseri의 경우 1:300입니다. 이 샘플 세트는 염색된(AB) 샘플입니다.
   7. 희석된 isotype 항체 50μL를 세 번째 세트에 추가합니다. 이 세트는 아이소타입 컨트롤(IC)이 됩니다. 피펫팅으로 잘 섞습니다. 얼음과 어둠 속에서 샘플을 30분 동안 배양합니다.
   8. 모든 시료를 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리기합니다.
   9. 상등액을 버리고 샘플을 100μL의 FCSB에 재현탁합니다.
   10. 5분 동안 10,000 x g에서 모든 샘플을 원심분리하고 상등액을 버리고 100μL의 FCSB에 샘플을 재현탁합니다.
   11. 모든 시료를 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리기합니다.
   12. 상층액을 버리고 샘플을 150μL의 FCSB에 재현탁합니다.
   13. 각 샘플을 총 부피 550μL에 대해 400μL의 FCSB 완충액이 포함된 FCSB 튜브로 옮깁니다.
   14. 유세포 분석으로 분석될 때까지 시료를 4°C에서 유지합니다.
       메모: 유세포 분석은 항체 염색 후 4시간 이내에 수행됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5ml 폴리스렌 라운드 바닥 튜브(셀 스트레이너 캡 포함	코 닝	352235	항체 염색 후 샘플은 유세포 분석을 위해 튜브로 옮겨집니다.
아나에로팩	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	R681001	Lactobacillus gasseri의 배양에 사용되는 혐기성 가스 팩
BD FacsDiva 소프트웨어
BD LSR Fortessa 유세포 분석기
소 세럼 알부민	Fisher 생물 시약	BP1605	유세포 분석에 사용
유세포 분석 염색 완충액(FCSB)	BD 바이오사이언스	554657	유세포 분석에 사용
마우스 IgG2b 카파 아이소타입 컨트롤(eBMG2b), PE, eBioscience	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	12473281	아이소타입 컨트롤. 이 항체는 제조업체에서 접합 형태로 구입합니다.
MRS 파우더	BD 바이오사이언스	288130	배지 준비 및 락토바실러스 가세리 배양에 사용됩니다.
노로바이러스 캡시드 G2 단클론 항체 (L34D)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	MA5-18241	노로바이러스 GII 항체. 이 항체는 unconjugated 형태로만 사용할 수 있으므로 설명된 유세포 분석 분석에서 사용하기 전에 형광 접합해야 합니다. 이 프로토콜에서 PE는 선택된 형광이었지만 연구원이 사용하는 유세포 분석기에 가장 적합한 다른 형광 분자를 선택할 수 있습니다.
노로바이러스 GII.4 VLP	창조적 인 생체 구조	CBS - V700	인간 노로바이러스 유사 입자, VLP는 바큘로바이러스 시스템을 사용하여 생성되었으며 10% 글리세롤이 함유된 인산염 완충 식염수에 재현탁되었습니다. 저자는 VLP의 입자 농도를 결정하기 위해 독립적인 나노사이트 추적 분석을 수행했습니다. 농도는 밀리리터당 약 1011VLP입니다. VLP의 단백질 농도에 따라 VLP 부착 분석에서 박테리아당 약 200개의 입자가 추가됩니다.
PBS 10배	Fisher 생물 시약	BP665	사용하기 전에 1X로 희석하십시오.
SiteClick R-PE 항체 라벨링 키트	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	S10467	접합되지 않은 항체의 labling에 사용되는 접합 키트.
소금	피셔 사이언티픽	S271	미디어 준비에 사용
트립톤	옥소이드	LP0042	미디어 준비에 사용
튜브 리볼버	써모피셔 사이언티픽	88881001	바이러스에 사용 : 박테리아 부착 분석. 최대 속도(40rpm)로 설정합니다.
효모 추출물	BD 바이오사이언스	212750	미디어 준비에 사용
한천	시그마	A7002	미디어 준비에 사용

) ) ) ) (영문) ) (영어)