형질전환 선충에서 Mitophagy를 검출하기 위한 In Vivo 분석

초록

출처: Fang, E. F., et al. 인간 세포에서 미토파지의 체외 및 생체 내 검출, C. Elegans, and Mice. J. Vis. Exp. (2017).

이 비디오는 예쁜꼬마선충의 미토파지를 연구하기 위한 생체 내 분석을 보여줍니다. 선충을 미토파지 유도 약물에 노출시키면 손상된 미토콘드리아의 미토파지 수용체인 DCT-1과 자가포식체막 단백질 LGG-1 사이의 공동 국소화에 의해 미토파지의 발생을 평가합니다.

프로토콜

1. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 미토파지(Mitophagy) 검출

참고: 선충 C. elegans는 유기체 수준에서 미토파지를 분석할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 미토파지를 모니터링하기 위해 두 가지 균주를 사용할 수 있습니다: (1) 미토콘드리아 표적 로셀라(mtRosella) 또는 (2) GFP와 융합된 미토파지 수용체 DCT-1과 Discosoma sp와 융합된 자가포식좀 마커 LGG-1. 적색 형광 단백질(DsRed).

1. Rosella 바이오센서를 사용한 미토패지 모니터링
   참고: Rosella는 pH에 민감하지 않은 DsRed와 pH에 민감한 GFP 변형체를 결합한 분자 바이오센서입니다. Rosella 바이오센서는 산성 리소좀(pH ~4.5)과 다른 세포 구획 간의 pH 차이를 활용합니다. 이 바이오센서는 Saccharomyces cerevisiae와 HeLa, HEK293 및 HCT116과 같은 여러 포유류 세포주에서 미토파지를 성공적으로 모니터링하는 데 사용되었습니다. 우리는 이 다재다능한 이중 형광 리포터를 채택하고 체벽 근육 세포에서 미토콘드리아 표적 로셀라(mtRosella)를 발현하는 형질전환 C. elegans 선충을 생성했습니다. Mitophagy 유도는 mtRosella 형광의 GFP/DsRed 비율 감소로 표시됩니다.
   1. 1일차: 해부 현미경을 사용하여 체벽 근육 세포에서 미토콘드리아 표적 로셀라(mtRosella)를 발현하는 기생충의 L4 유충을 해부 현미경을 사용하여 대장균(OP50)이 파종된 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에 선택합니다. 최소 3개의 3.5cm 접시에 10-20마리의 벌레/접시를 놓습니다. 선충을 20 °C.
      의 표준 온도에서 배양합니다. 메모: L4 유충의 식별 및 한 위치에서 다른 위치로 벌레를 옮기는 데 사용되는 픽을 만드는 방법을 포함하여 벌레 해부학에 대한 참조를 참조하십시오.
   2. 5일차: 15-20개의 L4 형질전환 유충을 선택하여 신선한 OP50 파종 NGM 플레이트로 옮겨 선충을 동기화합니다. 실험 조건당 최소 5개의 플레이트를 사용하십시오.
   3. 7일차: 미토파지에 영향을 미치는 관심 약물 또는 양성 대조군에 대한 차량 플레이트를 준비합니다.
      1. NGM 플레이트를 222μW/^cm2(강도)의 자외선으로 15분 동안 노출시켜 씨를 뿌린 대장균(OP50) 박테리아를 죽여 미토파지 유도 화합물이 박테리아에 의해 대사되지 않도록 합니다. 플레이트는 2,000J/m².
         로 노출되어야 합니다. 참고: 필요한 노출 시간(초) = 2,000/((μW/cm2 단위의 강도)*100).
      2. 파종된 NGM 플레이트의 상단에 관심 화합물을 추가합니다. 등가량의 화합물 비히클(디메틸 설폭사이드(DMSO)와 같은 화합물을 용해하는 데 사용되는 용매)을 비히클 플레이트에 음성 대조군으로 추가합니다. 미토파지 유도의 양성 제어를 위해 미토콘드리아 독성제인 파라콰트(8mM 최종 농도)를 사용했습니다. 치료 그룹의 한천 플레이트 상단에 190μL의 ddH₂O와 함께 10μL의 8M 파라콰트 스톡이 포함된 용액을 추가합니다. 비히클 그룹의 경우 한천 플레이트 상단에 190μL의 ddH₂O와 함께 10μL의 DMSO가 포함된 용액을 추가합니다.
         메모: 파라콰트 작업 솔루션은 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
      3. 약물 또는 차량이 전체 표면을 코팅할 때까지 플레이트를 부드럽게 휘젓습니다. 벌레를 옮기기 전에 실온에서 뚜껑을 닫고 접시를 최소 1시간 동안 건조시키십시오.
         메모: 약물 플레이트는 응고되기 전에 액체 NGM에 약물을 첨가하여 준비할 수도 있습니다.
   4. 7일차: 2.1.2단계에서 준비한 생후 2일 된 성체 형질전환 동물 10-20마리를 파라콰트, 관심 화합물 또는 비히클(DMSO)이 포함된 플레이트로 옮깁니다. 형질전환 동물을 20°C에서 2일 동안 배양합니다.
   5. 9일차: 아가로스 패드 2%를 준비합니다. 그런 다음 패드당 M9에 20mM 레바미솔 한 방울(10μL)을 추가합니다. 이미징을 위해 형질전환 동물을 M9-레바미솔 드롭에 넣어 고정시킵니다. 상단에 커버슬립을 부드럽게 놓습니다.
   6. epifluorescence microscope에 부착된 카메라를 사용하여 단일 형질전환 동물을 캡처합니다. 체벽 근육 세포에서 mtRosella를 발현하는 전체 형질전환 선충의 형광 이미지를 10X 배율로 획득합니다. 수집된 이미지를 저장합니다.
   7. ImageJ 소프트웨어로 획득한 이미지를 처리합니다. 장 조직의 자가형광을 피하기 위해 기생충의 머리에 위치한 체벽 근육 세포를 분석합니다. 각 형광 이미지에 대한 평균 픽셀 강도 값과 총 면적은 각 동물의 머리 부분만 측정합니다. 특정 관심 영역을 분석하려면 다음을 수행합니다.
      1. '이미지' 및 '색상' 드롭다운 메뉴에서 '분할 채널'을 선택하여 이미지를 변환합니다.
      2. 'freehand selection' 도구를 사용하여 관심 형광 영역을 캡처할 수 있습니다.
      3. 'analyze' 드롭다운 메뉴에서 'measurement' 명령을 선택하고 픽셀 강도 분석을 수행합니다.
      4. 픽셀 강도는 강도를 분석된 총 영역으로 나누어 정규화해야 합니다. 정규화 시 GFP 대 DsRed 비율을 계산합니다.
   8. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 p < 0.05가 유의한 통계 분석을 위해 학생 t-test(두 그룹 간 비교) 또는 ANOVA(여러 그룹 간 비교)를 수행합니다.
2. DCT-1과 LGG-1
   간의 공동 국소화를 사용한 미토파지 평가 참고: DCT-1은 포유류의 추정되는 orthologues BNIP3 및 NIX/BNIP3L과 유사하게 스트레스 조건에 반응하여 미토파지 수용체로 작용하는 외부 미토콘드리아 막 단백질입니다. 따라서, 미토파지 시작은 DCT-1 미토파지 수용체와 자가포식좀 막 단백질 LGG-1(포유류 LC3의 상동체) 사이의 공동 국소화에 의해 평가됩니다.
   1. 1일차: 체벽 근육 세포5에서 DCT-1::GFP 및 DsRed::LGG-1을 모두 발현하는 형질전환 동물의 L4 유충을 OP50 파종된 NGM 플레이트에 선택합니다. 5-10 개의 벌레 / 3.5cm 접시를 놓고 적어도 3 개의 접시를 사용하십시오. 선충을 20 °C에서 배양합니다 .
      메모: 전이유전자는 별도의 플라스미드에 위치하며 게놈에 통합되지 않습니다. rol-6(su1006) 및 pmyo-2 GFP contransformation marker를 모두 보유한 선충을 선택합니다. 두 형질전환 마커를 모두 가진 형질전환 웜만이 체벽 근육 세포에서 DCT-1::GFP와 DsRed::LGG-1을 모두 발현합니다.
   2. 1.1.2-1.1.5의 단계를 따릅니다.
   3. 컨포칼 현미경에 부착된 카메라를 사용하여 단일 체벽 근육 세포를 이미지화합니다. 전체 체벽 근육 세포의 경계를 감지하고 63배 배율로 z 스택 이미지를 촬영합니다. 더 높은 배율도 사용할 수 있습니다.
   4. 컨포칼 소프트웨어로 획득한 이미지를 열고 처리합니다. 미토파지의 시작은 미토파지 수용체(DCT-1::GFP)와 자가포식좀 마커(DsRed::LGG-1)의 공동 국소화에 의해 표시됩니다. 체벽 근육 세포의 각 스택에서 공동 국소화 이벤트를 수동으로 측정합니다. 실험 전반에 걸쳐 모든 현미경 및 카메라 설정(렌즈 및 돋보기, 필터, 노출 시간, 해상도, 레이저 강도, 게인 등)을 일관되게 유지하는 것이 중요합니다. 모든 설정을 기록해야 합니다.
   5. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 p < 0.05가 유의한 통계 분석을 위해 학생 t-test(두 그룹 간 비교) 또는 ANOVA(여러 그룹 간 비교)를 수행합니다. 양방향 비교의 경우 스튜던트 t-검정을 사용합니다(p < 0.05는 유의한 것으로 간주됨). 다중 비교의 경우 사후 Bonferroni 검정으로 수정된 단일 요인(ANOVA) 분산 분석을 사용합니다. 각 실험 조건에 대해 최소 50-70마리의 동물 또는 30-50개의 체벽 근육 세포를 분석하는 것이 좋습니다. 이 실험을 최소 3회 반복한다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Eclipse TE-2000e 컨포칼 현미경	니콘	#TE-2000E
공동 로컬라이제이션 소프트웨어	볼로시티	#Volocity 6.3	대체 Zeiss ZEN 2012 소프트웨어
IN 세포 조사자 소프트웨어	GE 헬스케어 생명과학	#28408974
세포 배양 배지	써모피셔	#DMEM-Dulbecco's Modified Eagle 배지
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)	써모피셔	#15140122
소 태아 세럼	시그마-알드리치	#12003C-1000ML
세포 배양 인큐베이터	써모피셔	#Thermo Forma 3110 CO2 워터 재킷 인큐베이터
epifluorescence microscope (에피 형광 현미경	자이스		자이스 악시오 이미저 Z2
사진기	올림푸스		올림푸스 DP71
컨포칼 현미경	자이스		자이스 악시오 옵저버 Z1
컨포칼 소프트웨어	자이스		젠 2012
이미지 분석 소프트웨어	이미지 J	공동 국소화 분석 등	https://imagej.nih.gov/ij/
통계 분석 소프트웨어	GraphPad Software Inc., 미국 샌디에이고,		GraphPad Prism 소프트웨어 패키지
웜 픽을 만들기 위한 재료	Surepure 체메탈	#의 4655	픽은 30 게이지 90 % 백금 10 % 이리듐 와이어로 만들어졌습니다
IR: N2; 예[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]	Tavernarakis Nektarios에 대한 자료 문의		형질전환 동물을 20°C에서 유지
IR: N2; 예[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]	Tavernarakis Nektarios에 대한 자료 문의
pmyo-3 TOMM-20::로젤라	Tavernarakis Nektarios에 대한 자료 문의
PDCT-1 DCT-1::GFP	Tavernarakis Nektarios에 대한 자료 문의
pmyo-3 DsRed::LGG-1	Tavernarakis Nektarios에 대한 자료 문의
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메틸 viologen dichloride 수화물	시그마-알드리치	#856177	파라콰트
선충을 위한 인큐베이터	아쿠아리틱		20°C를 유지하는 인큐베이터
해부 실체현미경	올림푸스	SMZ645
컨포칼 현미경	자이스	액시오옵저버 Z1	선충의 경우(2단계)
epifluorescence microscope (에피 형광 현미경	자이스	액시오이미저 Z2	선충의 경우(2단계)
UV 가교제	빌버 루르마트	바이오 링크 – BLX-E365	자외선 광원, 356nm

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