단백질 바이오마커 검출을 위한 모세관 전기영동 면역분석

초록

출처: Sage, J. M., et al. 인간 혈소판에서 근위축성 측삭 경화증의 잠재적 바이오마커를 검색하기 위한 모세관 전기영동 면역분석법 사용.J. Vis. 특급(2020년)

이 비디오는 인간의 혈소판에서 근위축성 측삭 경화증(ALS)과 관련된 단백질 바이오마커를 검출하기 위한 모세관 전기영동 면역분석 프로토콜을 보여줍니다. ALS 바이오마커 단백질의 존재 확인은 혈소판 단백질의 크기 기반 분리와 화학발광 검출을 통해 이루어집니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 완충액 및 시약의 준비

참고: 제조업체의 지침에 따라 모든 샘플을 준비하십시오. 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장비(실험실 가운, 장갑 및 고글)를 착용하십시오.

1. 0.941g의 수크로스(11mM 최종 농도), 6.4mL의 5M 염화나트륨(NaCl, 128mM 최종), 5.4mL의 0.2M 인산일나트륨(_NaH2PO4, 4.3mM 최종), 0.2M 인산이나트륨 9.4mL(_Na2HPO4, 7.5mM 최종), 0.352g의 시트르산나트륨(4.8mM 최종), 및 0.115g의 구연산(2.4mM 최종). ddH₂O를 사용하여 총 부피를 250mL로 조정합니다.0.45μm 필터 디스크를 통해 필터링하고 pH를 6.5로 조정합니다. 4°C에서 최대 1년까지 보관하십시오. 사용하기 전에 용액을 실온(RT)에 두십시오.
2. 100mL 최종 부피에 250mM 수크로스, 1mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 및 10mM 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄 염산염(Tris-Cl, pH 7.4)을 결합하여 파열 완충액을 준비합니다. 4°C에서 최대 1년까지 보관합니다. 2μL의 포스파타제 억제제 칵테일(1:1000 최종)과 1μL의 프로테아제 억제제 칵테일(1:2000 최종)을 2mL의 파열 완충액에 추가합니다. 사용할 때까지 얼음에 넣어 보관하십시오. 사용하지 않는 파열 버퍼를 버립니다.

2. 혈소판 분리

1. ACD(acid-citrate-dextrose) 용액(75mM 시트르산 삼나트륨, 124mM 덱스트로스 및 38mM 구연산, pH = 7.4)이 포함된 노란색 캡 혈액 채취 튜브에 인간 혈액 8-10mL를 수집합니다. ACD: blood = 1:9). 튜브 내용물을 손으로 5x-6x 반전하여 부드럽게 혼합합니다.
2. 스윙 버킷 로터에서 200 x g의 튜브를 실온 상온에서 20분 동안 원심분리합니다.
3. 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)(~3–4mL)을 15mL 원뿔형 바닥 튜브에 모으고 오염을 방지하기 위해 담황색 코트(흐릿하게 보이는 분획)에서 약 0.5mL의 PRP를 남겨둡니다. 적혈구 오염이 발생하면 이 단계를 반복하십시오.
4. PRP 샘플을 1,200 x g에서 RT에서 15분 동안 원심분리합니다.
5. 1mL의 시트레이트 세척 완충액에 부드럽게 재현탁하여 혈소판 펠릿(P1)을 세척하고 1,200 x g에서 상온에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛을 세척합니다.
6. 순수한 혈소판 펠릿을 보관하십시오. 상등액을 버리십시오.
7. 억제제 칵테일을 함유한 파열 완충액의 600μL에 혈소판 펠릿을 재현탁합니다.
8. 초음파 처리기를 사용하여 혈소판 현탁액을 초음파 처리합니다. 샘플을 미니 얼음 양동이에 넣습니다. 연속 모드에서 3초 동안 초음파 처리기를 20초 동안 설정합니다.
   알림: 10% 표백제로 프로브를 청소한 다음 증류수를 붓습니다.
9. 초음파 처리 된 샘플을 20,000 x g에서 4 ° C에서 30 분 동안 원심 분리하여 막질 분획을 제거합니다. 상층액을 60 μL에서 분취하고 -80 °C에서 보관합니다.혈소판 세포질 분획에 대해 반복적인 해동/동결 주기를 피합니다.

3. 모세관 전기영동 면역분석법(CEI) 준비

참고: ALS 환자(n = 8–10)로부터 100μL의 인간 혈소판 용해물을 결합하고, 건강한 피험자(n = 8–10)를 별도로 취합하여 분석 최적화에 사용했습니다.

1. CEI 레이아웃(표 1) 및 시료 준비(표 2)를 위해 사내에서 생성한 템플릿을 작성합니다. 샘플 혼합물 준비 테이블은 동적이며 source.
   에서 제거해야 하는 부피의 양을 자동으로 계산합니다. 참고: 필요한 소스 부피가 동적 표 2에 입력되면 0.1 X 샘플 버퍼 부피가 자동으로 계산됩니다.
2. capillary #1–#25가 있는 0.2 mL PCR 튜브 25개를 사전 라벨링하고 PCR 랙에 넣습니다. 얼음 위에 놓습니다.
3. 0.6mL 마이크로 원심분리 튜브에 사전 라벨링: 사용할 각 1차 항체 및 희석액(필요한 경우)에 하나씩, 0.1x 샘플 버퍼에 하나씩, 루미놀-S/과산화물에 하나씩, 희석할 각 샘플(필요한 경우)에 대해 하나씩. 튜브 랙의 얼음 위에 올려 놓습니다.
4. 샘플 버퍼, 세척 버퍼, 플레이트 1개 및 CEI 분리 12–230 kDa 마스터 키트 분리 모듈에 제공된 카트리지를 꺼냅니다.
5. 4°C 냉장고에서 항체 희석 완충액, 1차 항체, 2차 항체, 루미놀, 과산화수소, 스탠다드 팩을 꺼냅니다. RT.
   로 유지되는 표준 팩을 제외한 모든 시약을 얼음 위에 놓습니다. 참고: 표준 팩의 시약은 동결건조되어 호일 덮개로 밀봉되어 있습니다. 제품 손실을 줄이려면 개봉하기 전에 미니 원심분리기를 사용하여 잠시 회전시켜야 합니다. 시약 튜브를 열려면 피펫 팁으로 구멍을 뚫거나 모서리에서 뒤로 당길 수 있습니다.
6. 400mM 디티오트레이톨(DTT)을 준비하려면 DTT가 들어 있는 투명 튜브에 40μL의 탈이온수를 추가합니다.
7. 40μL의 형광 5x 마스터 믹스를 준비하려면 20μL의 10x 샘플 버퍼와 준비된 400mM DTT 용액 20μL를 키트에 제공된 분홍색 튜브에 추가합니다.
8. 비오틴화 ladder를 준비하기 위해 키트에 제공된 흰색 튜브에 탈이온수 16μL, 10x 샘플 완충액 2μL, 준비된 400mM DTT 용액 2μL를 추가합니다. 부드럽게 혼합하고 변성을 위해 0.2mL 중합효소연쇄반응(PCR) 튜브로 옮깁니다.
9. 0.6mL 마이크로 원심분리 튜브에 1.5μL의 10x 샘플 버퍼와 148.5μL의 탈이온수를 추가하여 0.1x 샘플 버퍼를 준비합니다. 소용돌이가 섞여 얼음 위에 놓습니다.
10. 원하는 항체 희석액을 준비합니다. 사전 라벨링된 각 마이크로 원심분리 튜브에 지정된 부피의 항체 희석제를 추가합니다. 부피가 동일한 경우 역 피펫팅 기법을 사용하십시오. 그렇지 않은 경우 분배하기 전에 피펫 팁을 미리 헹굽니다.
    참고: 본 분석에는 A-TDP-43 pan 항체 및 a-p(S409/410-2) TDP-43 항체가 사용되었습니다. 항-ERK 항체는 분석 성분이 작동하는지 확인하기 위해 내부 통제에 사용되었습니다.
11. 아래와 같이 항체 희석을 위한 역 피펫팅을 수행합니다. 또는 문헌에서 추가 정보를 찾을 수 있습니다.
    참고: 역 피펫팅은 소량의 용액을 순차적으로 분주할 때 선호됩니다. 이 기법은 (i) 정확한 부피를 제공하고, (ii) 팁 오리피스에서 시약 거품을 제거하고, (iii) 소량(<5μL) 시약, 점성 용액, 계면활성제 용액 및 증기압이 높은 용액에 이상적이라는 몇 가지 이점을 제공합니다.
    1. 피펫에 적절한 팁을 넣고 플런저를 두 번째 스톱까지 누릅니다(2단계). 피펫 팁을 용액에 몇 밀리미터 담그십시오. 팁이 아직 잠겨 있는 동안 플런저를 천천히 놓아 피펫 팁에 용액을 채웁니다. 용액에서 팁을 제거하고 시약 저장소의 가장자리를 부드럽게 만져 팁 외부에 남아 있는 과도한 액체가 제거되도록 합니다.
    2. 플런저를 첫 번째 스톱으로 눌러 용액을 분배합니다(1단계). 팁에 남아 있는 용액을 분배하지 마십시오.
    3. 플런저를 두 번째 정지 지점까지 눌러 팁의 나머지 용액을 시약 저장소로 비웁니다(2단계). 플런저를 다음 피펫팅 단계를 위한 준비 위치로 놓습니다.
    4. 사전 라벨링된 각 마이크로 원심분리 튜브에 지정된 부피로 필요한 항체를 추가합니다(표 1). 피펫 팁을 미리 헹구지 마십시오: 희석제에 직접 넣고 팁을 여러 번 세척하여 항체를 제거합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
12. CEI 샘플 혼합물을 준비하려면 cap#2에서 cap#25로 표시된 PCR 튜브에 대해 아래 나열된 단계를 수행합니다. 이는 표 1과 동일한 순서입니다.
    1. 모든 튜브를 열고, 역 피펫팅 기법을 사용하여 각 튜브에 1.6μL 형광 5x 샘플 버퍼를 추가한 다음, 5x 버퍼를 추가하면 각 PCR 튜브를 닫아 샘플 손실을 최소화합니다.
    2. 모든 튜브를 열고 표 2에 지정된 부피의 0.1x 샘플 버퍼를 각 튜브에 추가한 다음 즉시 닫습니다. 부피가 동일한 경우 역 피펫팅 기법을 사용하십시오. 그렇지 않은 경우 0.1x 샘플 버퍼를 분주하기 전에 피펫 팁을 미리 헹굽니다.
    3. 모든 튜브를 열고 표 2에 지정된 부피의 단백질 샘플을 각 튜브에 추가한 다음 즉시 닫습니다. 부피가 동일한 경우 역 피펫팅 기법을 사용하십시오. 그렇지 않은 경우 0.1x 샘플 버퍼를 분주하기 전에 피펫 팁을 미리 헹굽니다.
    4. 벤치탑 원심분리기(30초 동안 13,000 x g)에서 모든 PCR 튜브를 간단히 원심분리하고 PCR 튜브를 플릭/볼텍스 튜브로 혼합한 다음 원심분리를 반복합니다.
    5. 모든 PCR 튜브를 가열된 뚜껑이 있는 써모사이클러로 옮깁니다. 정의된 온도 및 지속 시간(즉, 95°C에서 5분, 70°C에서 10분)으로 샘플을 변성시킵니다.
       참고: 변성 온도와 지속 시간은 타겟 단백질에 맞게 최적화되어야 합니다.
    6. 3.12.4단계를 반복합니다.
    7. 모든 PCR 튜브를 튜브 랙에 다시 넣고 얼음 위에 놓습니다.
    8. 변성 단계에서 개발 용액(1:1 luminol-S: 과산화물 용액)을 준비한 다음 200μL의 luminol-S와 200μL의 과산화물을 첨가합니다. 얼음 위에 놓습니다.
    9. CEI 사전 충전 플레이트에 위에서 준비한 샘플을 로드하려면 시약과 샘플을 분석 레이아웃에 표시된 분석 플레이트에 분배합니다(그림 1). 기포가 유입되지 않도록 하십시오.
       참고: 부피와 용액이 동일한 경우 역 피펫팅 기술을 사용하십시오. 그렇지 않은 경우 분배하기 전에 피펫 팁을 미리 헹구고 피펫의 두 번째 탭 스톱을 사용하여 나머지를 플레이트로 잘 배출하지 마십시오. 12–230 kDa 분리 모듈에는 색상으로 구분된 플레이트 로딩 가이드가 포함될 수 있습니다. 이 가이드를 플레이트 아래에 놓고 시약과 샘플을 웰에 추가하면 샘플을 주입할 때 시각적으로 도움이 됩니다. 플레이트 적재 가이드는 회사 웹 사이트에서도 다운로드할 수 있습니다.
       1. 15μL의 루미놀 : 과산화물 혼합물을 E 행
          행의 각 웰에 추가합니다. 참고: 이상적으로는 사용 직전에 이 시약을 준비하고 각 웰에 첨가하는 것이 좋습니다. 이것이 불편한 경우, 이 혼합물은 플레이트 로딩 30분 전에 준비될 수 있습니다.
       2. D행에서 D1 웰에 10μL의 스트렙타비딘-HRP를 추가합니다.
       3. D행의 D2–D25 웰에 지정된 2차 항체 10μL를 추가합니다.
       4. B행에서 각 웰에 10μL의 항체 희석제를 추가합니다.
       5. C행에서 웰 C1에 10μL의 항체 희석제를 추가합니다.
       6. C행의 C2–C25 웰에 10μL의 지정된 1차 항체를 추가합니다.
       7. A열에서 A1 웰에 PCR 튜브 #1에서 5μL의 비오틴화 래더를 추가합니다.
       8. A 행에서 웰 A2–A25에 샘플 3μL, PCR 튜브 #2–#25를 해당 웰 #2–#25에 추가합니다.
       9. 지정된 각 세척 완충액 웰에 500μL의 세척 완충액을 추가합니다.
       10. 상온에서 1,000 x g에서 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다.

표 1: CEI 분석 플레이트 로딩 템플릿.

표 2: 대화형 샘플 혼합물 준비 템플릿. 미확인 샘플에서 스톡 단백질 농도를 입력한 후, 대화형 셀은 샘플 혼합물을 준비하는 데 사용해야 하는 부피의 양을 자동으로 계산합니다.

결과

그림 1: 분석 레이아웃.1차 항체와 표적 단백질 시료 최적화를 모두 하나의 분석으로 수행할 수 있습니다. 모세혈관 2-7, 8-13, 14-19 및 20-24는 다양한 단백질 농도와 1차 항체 범위를 나타냅니다. 모세관 25는 양성 대조군을 나타냅니다. 항-ERK 항체가 사용되었다. 그러나 적절한 양성 대조군이 포함될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12-230 kDa 분리 키트	프로테린심플	SM-W004	사전 충전된 분석 플레이트와 25채널 모세관 카트리지 포함
3000G 열순환기	테크네	FTC3G/02	우리는 샘플 혼합물을 가열하기 위해 이 열원체를 사용했습니다
안티 마우스 감지 키트	프로테린심플	제042-205	HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker 포함
Anti-P(S409-410) TDP-43 항체	프로테인터테크	22309-1-AP	인산화된 TDP-43을 인식하는 1차 항체
Anti-P(S409-412) TDP-43 항체	코스모바이오-USA	팁-PTD-P02	인산화된 TDP-43을 인식하는 1차 항체
Anti-Rabbit 탐지 키트	프로테린심플	디엠-001	HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker 포함
Anti-TDP-43 (pan) 항체	프로테인터테크	10782-2-AP	전체 TDP-43 단백질을 인식하는 1차 항체
소닉 디스멤브레이터; 모델100	피셔 사이언티픽		초음파 처리기. 세포막을 파열하는 데 사용됩니다. 이 모델은 단종되었습니다(모델 XL2000-350).
탁상용 원심분리기	에펜도르프	22625004	모델# 5810(스윙 플레이트 버킷 포함
웨스 분석기	프로테린심플	55892-WS-2203	모세관 겔 전기영동을 수행합니다.
SimpleWestern용 나침반(SW)	프로테린심플	버전 4.0.0.	Compass for SW는 SimpleWestern 기기를 위한 제어 및 데이터 분석 애플리케이션입니다

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