미세유체 소자를 이용한 자성 나노입자 기반 면역분석법

초록

출처: Hernández-Ortiz, J. A., et al. 자성 나노 입자 기반 면역 분석에 대한 엇갈린 제한이 있는 미세유체 아크릴 장치의 컴퓨터 수치 제어 마이크로 밀링. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 자기 나노 입자 기반 면역 분석을 위한 미세유체 시스템을 보여줍니다. 감지 시스템은 채널 내에 자기 트랩을 통합한 미세유체 장치를 사용합니다. 1차 항체와 과산화효소 접합 2차 항체에 결합된 항원 코팅된 자성 나노입자로 구성된 사전 형성된 면역복합체가 채널로 도입됩니다. 면역복합체는 외부 자기장을 가할 때 다공성 자기 트랩에 포획됩니다. 과산화효소(peroxidase)에 의한 촉매 작용 시 형광을 방출하는 형광성 기질을 사용하여 포획된 면역복합체를 현미경으로 검출합니다.

프로토콜

1. 장치 준비

1. 주사기를 사용하여 채널을 증류수로 채웁니다. 누출이나 흐름에 대한 저항이 없는지 확인하십시오. 장치를 초음파 수조에 10분 동안 담그어 채널 내부에 남아 있는 아크릴, 접착제 또는 원치 않는 물질을 제거합니다.
2. 장치 채널 내부의 물을 비우십시오. 주사기를 사용하여 1x Tris-buffered saline(TBS)에 희석하고 0.2μm 폴리에테르설폰(PES) 주사기 필터를 통해 미리 여과한 5%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)으로 준비한 차단 용액을 주입합니다.
3. 직경 7.5μm의 철 미립자를 5% BSA.
   로 현탁액 준비합니다. 메모: 미립자는 이전에 단백질 흡수에 대한 저항성을 부여하는 실리카-폴리에틸렌 글리콜(PEG) 층으로 기능화되었습니다.
4. 칩과 미립자 현탁액을 차단 용액과 함께 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 가능하면 4°C에서 밤새 차단하십시오.

2. 미립자 트랩 형성

1. 측면 채널 배출 호스를 통해 주사기 바늘로 미세 입자를 칩에 삽입합니다. 칩을 수직으로 놓고 미세 입자가 측면 채널을 통해 중력의 영향으로 흐르도록 합니다. 칩을 90°의 두 단계로 180° 회전하고 미세 입자가 5μm 제한에서 표적이 되고 압축되도록 합니다.
2. 측면 채널을 향해 45° 회전하는 중력에 의해 과도한 미세 입자를 제거합니다.
3. 미세 입자 트랩이 해제되지 않도록 장치를 똑바로 세우십시오. 그림 1B를 참조하여 마이크로입자 트랩 형성 과정에 대한 요약을 확인하십시오.

3. 면역분석

1. 나노 입자 준비
   1. 이전에 라이소자임(항원 모델)과 접합된 100nm 나노 입자의 현탁액 2μL를 취합니다. 100μL의 차단 용액이 있는 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 4 °C에서 밤새 배양하십시오.
   2. 150μL의 세척 버퍼(1x TBS, 0.05% Tween 20)를 추가합니다.
   3. 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브를 자기 분리기에 놓습니다. 나노 입자가 분리될 수 있도록 15분 동안 유지합니다(그림 2).
      메모: 자기 분리기의 최소 부피는 200μL입니다. 더 작은 부피는 사용하지 마십시오.
   4. 마이크로피펫으로 튜브에서 액체를 제거합니다. 나노 입자 펠릿이 형성된 튜브의 벽과의 접촉을 피하십시오.
   5. 250μL의 신선한 세척 버퍼를 추가합니다. 튜브를 15분 동안 교반한 상태로 유지합니다.
   6. 3.1.3.-3.1.5. 단계를 2배 더 반복하고 5분 동안만 흔듭니다.
   7. 원하는 농도의 1차 항라이소자임 항체를 추가합니다(재료 표 참조). 항체 희석제(1x TBS, 1% BSA, 0.05% Tween 20)에서 최종 부피 100μL로 조정합니다.
   8. 37 °C에서 15분 동안 배양하고 실온에서 15분 더 흔듭니다.
   9. 세탁 단계 3.1.2.-3.1.6을 반복합니다.
   10. 항체 희석제 100μL를 추가합니다. 양고추냉이 과산화효소 결합 2차 항체(HRP-AbII)(재료 표 참조)를 1:500의 희석액으로 추가합니다.
   11. 세탁 단계 3.1.2.-3.1.6을 반복합니다.
   12. 나노 입자를 항체 희석제 50μL의 최종 부피로 유지합니다.

4. 실험용 장착

1. 100μL 유리 주사기 2개에 물을 채우고, 6.5cm 길이의 호스를 각 주사기에 연결하고, 호스 끝에 금속 핀을 삽입하고, 두 주사기를 컴퓨터 제어 주사기 펌프에 놓습니다.
2. 아크릴 장치의 모든 호스를 열로 밀봉하십시오.
3. 흡입 호스를 자르고 몇 밀리미터 만 유지하십시오. 디스펜싱 바늘에 세척액을 채우고 절단된 호스에 삽입합니다. 공기가 장치에 접근하는 것을 방지하기 위해 바늘을 장치에 연결하기 전에 용액이 떨어지도록 하십시오.
4. 측면 채널에서 배출 호스를 절단합니다. 주사기 펌프에 연결합니다. 그런 다음 주 채널 배출 호스에 대해 동일한 절차를 수행합니다.
   메모: 4.3.-4.4 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 이 순서대로, 마이크로입자 트랩의 포장을 풀지 않도록 합니다. 가능하면 돋보기를 사용하여 이 단계에서 트랩의 상태를 확인합니다.
5. 현미경 스테이지에 유리 슬라이드를 놓습니다. 양면 테이프로 슬라이드에 자석을 부착하고 양쪽에 작은 테이프 조각을 놓아 칩 가장자리를 유리에 고정합니다.
6. 실린지 펌프 컨트롤러의 Flow Rate(유량) 및 Units(단위) 탭을 통해 50μL/h의 유량을 설정합니다. 인출 모드를 선택하고 시작 버튼을 클릭하여 세척 버퍼의 흐름을 활성화합니다.
7. 조심스럽게 자석이 있는 슬라이드 쪽으로 장치를 수평으로 접근하여 트랩을 포함하는 칩 영역이 자석에 닿도록 합니다.
8. 움직임을 방지하기 위해 양면 테이프로 장치의 가장자리를 유리에 붙입니다. 현미경 검사를 위해 광학 경로를 방해하지 마십시오(그림 1C).

5. 면역 검출

1. 과도한 BSA를 제거하기 위해 50μL/h에서 10분 동안 세척 버퍼를 계속 흐르게 합니다.
2. 마이크로피펫으로 디스펜싱 바늘에 남아 있는 세척 버퍼를 제거합니다. 나노 입자 현탁액 50μL를 추가합니다.
3. 100μL/h의 유속으로 7분 동안 나노 입자의 현탁액을 흐릅니다. 그런 다음 유속을 50μL/h로 변경하고 15분 더 흐릅니다.
4. 디스펜싱 바늘을 교체하십시오. 세척 버퍼를 50μL/h에서 10분 동안 흐릅니다. 세척 단계에서 제조업체의 사양에 따라 형광 기판을 준비합니다.
5. 마이크로피펫으로 디스펜싱 바늘에 남아 있는 세척 버퍼를 제거합니다. 100μL의 형광 기질을 추가합니다(재료 표 참조). 불소 기반 기판을 50μL/h에서 6분 동안 흘려보냅니다.
6. 주사기 펌프를 제어하는 인터페이스의 해당 유량 및 타이머 설정 탭에서 유량(1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h 및 10 μL/h) 및 시간(6분) 측정 매개변수를 설정합니다. 수행할 각 측정에 대해 인출 모드를 선택해야 합니다.
7. 추가 유량 탭을 50μL/h로 설정하고 세척 단계를 위해 타이머를 3분으로 설정합니다.
8. 50μL/h의 기판이 멈추기 15초 전에 현미경의 형광을 켭니다. 기판이 1,000밀리초의 노출 시간으로 멈추기 10초 전에 현미경 카메라의 소프트웨어로 이미지 캡처를 시작합니다. 1프레임/초(FPS)에서 6분 동안 이미징을 수행합니다.
9. 50 μL/h에서 기판 세척 유량이 멈춘 직후 원하는 유량 매개변수의 시작 버튼을 클릭합니다. 선택한 측정 흐름이 중지된 직후 세척 흐름(50 μL/h)의 시작 버튼을 클릭합니다.
10. 이미지 캡처를 중지하고 현미경의 형광을 꺼서 기판의 광표백을 방지합니다.
11. 사용된 각 측정 유량에 대해 5.8.-5.10 단계를 반복합니다.

결과

그림 1: 최종 장치 구성. (A) 해당 입력 및 출력에 연결된 호스가 있는 아크릴 장치. 눈금은 장치의 치수를 센티미터 단위로 표시합니다. (B) 미세입자 트랩의 형성을 위한 프로토콜. 미세 입자는 장치가 수직 위치에 있을 때 중력에 의해 채널을 통해 흐릅니다. 미세입자는 5μm 제한에 집중되어 있습니다. 과도한 미세입자는 측면 채널을 통해 칩을 회전시켜 쉽게 제거할 수 있습니다. 칩은 면역 분석 전에 트랩을 보존하기 위해 수직으로 유지됩니다. (C) 도립 형광 현미경의 무대에 자석이 포함된 유리 슬라이드에 장착된 미세유체 장치. 시약이 추가되는 분배 바늘과 주사기 펌프에 연결되는 배출 호스가 관찰됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
카르보닐-철 미립자	시그마-알드리치	44890	7 μm
클로로포름	페르몬트	6201	건강 위험: 보통 가연성 : 없음 반응성: none 접촉 위험: 보통
CMOS 카메라 모멘트	Teledyne 측광		센서 기술: CMOS 양자 효율 : 73 % 픽셀 크기: 4.5 μm x 4.5 μm 지원 인터페이스: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave 소프트웨어	롤랜드 DGA 코퍼레이션		표면에 조각 경로를 설계하고 생성하는 조각 소프트웨어
추출 후드	알려지지 않은	알려지지 않은
유연한 플라스틱 튜브	타이곤	AAD04103	아이디 = 0.020, OD = 0.060
형광 마이크로솝	자이스	악시오 Vert.A1
고정밀 디스펜스 바늘	록타이트	98612
MagJET 분리 랙	열과학		12 x 1.5 mL
폴리 메틸 메타 크릴 레이트 - 시트 - PMMA, 아크릴	굿펠로우	ME303018/1	두께: 1.3mm, 투명도: 투명/투명
PVCamTest 소프트웨어	Teledyne 측광	버전 3.10.107	이미지 획득 소프트웨어
실체 현미경	니콘	재질 보기 SMZ 7457
SuperMag 카르복실 비드	오션 나노텍	KSC0100	100 nm의
주사기 펌프	kd 사이언티픽	KDS200	최대 2개의 주사기를 수용할 수 있습니다.
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