암세포의 복제 스트레스를 정량화하기 위한 면역형광 기반 방법

Abstract

출처: Ramakrishnan, N. et al., Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-stranded DNA Immunofluorescence(단일 가닥 DNA 면역형광을 사용하여 난소암 세포의 복제 스트레스 정량화).J. Vis. 특급 (2023)

이 비디오는 암세포의 복제 스트레스를 정량화하기 위한 면역형광 기반 접근 방식을 보여줍니다. 하이드록시우레아(Hydroxyurea) 처리된 세포는 면역형광을 통해 검출되는 단일 가닥 DNA를 생성합니다. 녹색 형광 초점의 수는 암세포의 복제 스트레스 수준을 나타냅니다.

Protocol

참고: 이 단계에서는 난소암 세포주인 OVCAR3이 사용되었지만, 이 프로토콜은 비난소 공급원에서 유래한 세포주를 포함하여 여러 다른 세포주에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 프로토콜의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 셀 도금

1. 폴리-L-라이신 코팅된 커버슬립을 만듭니다.
   1. 폴리-L-라이신 용액이 담긴 50mL 원뿔형 튜브에 오토클레이브 12mm 직경의 커버슬립을 추가하고 15분 동안 로커에 올려 놓습니다.
   2. 조직 배양 후드에서 용액을 흡입합니다. 멸균수를 추가하여 커버슬립을 세척하고 커버슬립이 들어 있는 튜브를 5분 동안 로커에 다시 놓습니다. 이 세척 단계를 세 번 반복합니다.
   3. 코팅된 커버슬립을 멸균 접시에 펴고 남아 있는 물을 흡입합니다. 조직 배양 후드에서 커버슬립을 1시간 동안 또는 물방울이 남지 않을 때까지 건조시킵니다. 건조되면 파라필름으로 접시를 밀봉하고 4°C에 놓습니다.
2. 24웰 플레이트의 각 웰에 폴리-L-라이신 코팅된 커버슬립 1개를 놓습니다. poly-lysine coverslips의 사용은 사전 추출 단....

Results

그림 1: IdU 라벨링 회로도.세포는 두 번의 집단 배가를 위해 IdU로 펄스됩니다. 약물 치료가 필요한 경우, IdU가 있는 상태에서 첫 번째 개체군이 두 배로 증가한 후 투여해야 합니다.

그림 2: IdU, BrdU 또는 CldU로 펄스한 후 얻은 초점 신호 비교.세 가지 다른 티미딘 유사체로 펄스된 세포의 대표 이미지. DAPI, GFP(Alexa-488 레이블 IdU 초점을 나타냄) 및 병합된 채널이 표시됩니다. 기준자: 10 μm.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% 파라포름알데히드(PFA)	피셔 사이언티픽	NC0179595	10g 자당 + 100mL 10X PBS + 물을 925mL로 부피를 만듭니다. 75mL 40% 메탄올 무함유 PFA를 첨가하고 혼합한 후 50mL의 부분 표본을 만든 후 보관 저장 : -20 °C에 보관하십시오
5-요오도-2'-데옥시우리딘(IdU)	시그마 알드리치	I7125-5G	MW = 354.10g/몰. 10mM 스톡의 경우: 3.541mg IdU를 1mL 1N 액체 암모니아에 용해
Anti-BrdU 항체	BD 바이오사이언스	347580	저장 : 4 °C에 보관하십시오
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 2차 항체	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	A32766 (영문	빛에 민감 - 어두운 곳에 보관
소 혈청 알부민(BSA)	시그마 알드리치	A7906-100G	PBS 의 부피에 특정 질량을 추가하여 제작 저장 : 4 °C에 보관하십시오
원형 커버 유리	전자 현미경 과학	72230-01
오브카3	증권 시세	HTB-161	성장 배지: L-글루타민, 0.01mg/mL 소 인슐린이 보충된 RPMI, 최종 농도 20%의 소 태아 혈청 및 1X Pen Strep 저장 : 동결 매체 : 성장 매체 + 5 % DMSO 및 -80 °C에 보관
Poly-L-Lysine 용액	시그마 알드리치	P4832-50ML	저장 : 4 °C에 보관하십시오
DAPI를 사용한 ProLong 다이아몬드 안티페이드 마운턴트	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	P36962	저장 : 4 °C에 보관하십시오
트립신-EDTA, 0.25%	제네시 사이언티픽	25-510	저장 : 4 °C에 보관하십시오
물, 멸균 여과	시그마 알드리치	W3500-6X500ML	저장 : 4 °C에 보관하십시오