암세포의 복제 스트레스를 정량화하기 위한 면역형광 기반 방법

Abstract

출처: Ramakrishnan, N. et al., Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-stranded DNA Immunofluorescence(단일 가닥 DNA 면역형광을 사용하여 난소암 세포의 복제 스트레스 정량화).J. Vis. 특급 (2023)

이 비디오는 암세포의 복제 스트레스를 정량화하기 위한 면역형광 기반 접근 방식을 보여줍니다. 하이드록시우레아(Hydroxyurea) 처리된 세포는 면역형광을 통해 검출되는 단일 가닥 DNA를 생성합니다. 녹색 형광 초점의 수는 암세포의 복제 스트레스 수준을 나타냅니다.

Protocol

참고: 이 단계에서는 난소암 세포주인 OVCAR3이 사용되었지만, 이 프로토콜은 비난소 공급원에서 유래한 세포주를 포함하여 여러 다른 세포주에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 프로토콜의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 셀 도금

1. 폴리-L-라이신 코팅된 커버슬립을 만듭니다.
   1. 폴리-L-라이신 용액이 담긴 50mL 원뿔형 튜브에 오토클레이브 12mm 직경의 커버슬립을 추가하고 15분 동안 로커에 올려 놓습니다.
   2. 조직 배양 후드에서 용액을 흡입합니다. 멸균수를 추가하여 커버슬립을 세척하고 커버슬립이 들어 있는 튜브를 5분 동안 로커에 다시 놓습니다. 이 세척 단계를 세 번 반복합니다.
   3. 코팅된 커버슬립을 멸균 접시에 펴고 남아 있는 물을 흡입합니다. 조직 배양 후드에서 커버슬립을 1시간 동안 또는 물방울이 남지 않을 때까지 건조시킵니다. 건조되면 파라필름으로 접시를 밀봉하고 4°C에 놓습니다.
2. 24웰 플레이트의 각 웰에 폴리-L-라이신 코팅된 커버슬립 1개를 놓습니다. poly-lysine coverslips의 사용은 사전 추출 단계에서 coverslips에서 세포가 분리되는 것을 방지하는 데 중요합니다.
3. OVCAR3 세포가 70%-80% 포화도에 도달하면 트립신화합니다.
   1. 70%-80% 융합된 10cm 배양 접시를 트립신화하려면 플레이트에서 배지를 흡인하고 5-7mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.
   2. PBS를 흡인하고 0.25% 트립신 1mL를 첨가한 다음 접시를 37°C 인큐베이터에 8-10분 동안 또는 세포가 플레이트 바닥에서 들어 올려질 때까지 놓습니다.
   3. 5-10mL의 배지로 세포를 수집하고 원뿔형 튜브에 추가합니다.
   4. 표준 절차를 사용하여 혈구계로 수동으로 세포를 계수합니다.
4. 25,000 cells/mL를 희석하고 24-well plates의 well에 배치된 poly-L-lysine coverslips에 세포 1mL를 추가합니다. 다른 세포주의 경우, 3번의 집단 배가 후 세포가 약 70%-80% 융합되는 숫자를 결정합니다.
5. 표준 조건에서 배양 배지에서 세포를 성장시킵니다.

2. IdU를 사용한 펄스 셀

1. 세포가 커버슬립에 적절하게 퍼져나가려면 한 번의 집단 배가만으로도 충분합니다. 한 번의 집단 배가 후, 두 번의 후속 집단 배가에 대해 10μM 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)으로 세포를 펄스합니다(IdU를 재구성하는 방법에 대한 재료 표 참조).
   메모: 우리는 브로모데옥시우리딘(BrdU), 5-클로로-2'-데옥시우리딘(CIdU) 및 IdU를 포함한 다양한 티미딘 유사체를 시도했습니다. 세 가지 아날로그 중에서 IdU는 최고의 신호 대 잡음비를 제공합니다. 세 가지 다른 유사체로 펄스된 세포의 비교 이미지가 그림 2에 나와 있습니다. 두 가지 음성 대조군, 즉 (i) IdU 없음 펄스 샘플과 (ii) 1차 항체 대조군이 없는 대조군을 사용하는 것이 좋습니다. 주어진 치료법으로 인해 ssDNA의 형성을 평가해야 하는 경우, IdU 더블링의 첫 번째 라운드 후에 약물을 추가하는 것이 좋습니다.
2. 두 번의 집단 배가를 위해 IdU로 펄스를 한 후 이미징을 위해 세포를 수확합니다.
   1. 매체를 얼음 위에서 0.5분 동안 얼음 위에서 얼음처럼 차가운 0.5% PBSTx(PBS + 0.5% Triton X-100)로 교체합니다. 이 추출 전 단계는 세포질 단백질과 염색질 결합 단백질을 분리하여 염색질 결합 단백질을 그대로 유지하는 데 도움이 됩니다.특정 세포주는 사전 추출 중에 쉽게 벗겨질 수 있습니다. 이러한 시나리오에서는 0.5% CSK 버퍼(10mM PIPES(pH 6.8), 100mM 염화나트륨(NaCl), 300mM 자당, 3mM 염화마그네슘(MgCl₂), 1mM 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA) 및 0.5% 트리톤 X-100)을 사용할 수 있습니다.

3. 고정

1. PBSTx를 흡입하고 실온에서 3% 파라포름알데히드(PFA)(Table of Materials)로 15분 동안 배양한 다음 1x PBS로 3-4회 세척합니다. 고정 셀은 추가 단계가 있을 때까지 4°C로 유지할 수 있습니다.
   주의: PFA는 독성이 강하고 발암성이 있습니다. 피부, 눈, 점막과의 접촉을 피하십시오. 흄 후드에서 PFA로 모든 단계를 수행하고 재료를 적절하게 폐기하십시오.

4. 투과와 차단

1. 고정 후 얼음에서 0.5% PBSTx를 사용하여 5분 동안 세포를 투과시킵니다.전체 커버슬립을 덮을 수 있을 만큼 충분한 부피(일반적으로 500μL에서 1mL 사이)를 사용합니다.
2. 실온에서 0.2% PBST(1X PBS + 0.2% Tween-20)로 세포를 3-4회 세척합니다. PBST 1mL는 각 우물을 세척하기에 충분합니다. 배양 없이 연속적으로 세척을 수행하십시오.
3. PBST를 흡인하고 실온에서 30분 동안 1x PBS(차단 버퍼)로 만든 5% 소 혈청 알부민, BSA(Table of Materials)를 사용하여 샘플을 차단합니다.

5. IdU 항체를 이용한 면역염색

1. 면역 염색을 위해 가습실(바닥이 평평한 타파웨어에 젖은 종이 타월)을 준비합니다. 24웰 플레이트의 뚜껑을 파라필름으로 덮고 가습실에 넣고 플레이트 뚜껑에 커버슬립을 놓습니다.
2. 4.2단계의 차단 버퍼에 항-BrdU 1차 마우스 항체(Table of Materials)를 1:200으로 희석하여 준비합니다. 항-BrdU 항체는 이전에 IdU를 검출하는 것으로 나타났습니다.
3. 커버슬립 상단에 IdU 항체 희석 60μL를 추가합니다. 커버 슬립을 37 ° C에서 1 시간 동안 배양합니다.
   1. 또는 파라필름에 1:200 항체 희석 피펫을 한 방울(20-25 μL)로 뒤집어 커버슬립을 뒤집는 경우 더 적은 항체 용액을 사용합니다. 이것은 또한 배양 중에 용액이 건조될 가능성을 줄입니다.
4. 1시간 배양 후 1차 항체를 흡인합니다. 커버슬립을 24웰 플레이트에 다시 넣고 0.2% PBST로 4회 세척합니다.
5. 2차 항체의 경우, 5.1단계에서 설명한 것과 동일한 가습 챔버를 사용합니다. 차단 버퍼(1:200)에서 anti-mouse conjugated secondary antibody(Table of Materials)를 희석합니다. 커버슬립에 60μL의 2차 항체를 추가하고 실온에서 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 이 2차 항체는 빛에 민감합니다.
6. 2차 항체를 흡인합니다. 커버슬립을 24웰 플레이트로 다시 넣고 0.2% PBST로 4회 세척합니다.
7. 현미경 슬라이드에 라벨을 붙이고 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 장착 매체(재료 표)를 사용하여 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다. 슬라이드는 실온에서 24시간 동안 어두운 곳에 보관하십시오. 24시간 배양은 장착 매체를 경화하거나 강화해야 하는 경우 권장됩니다.
   메모: 그런 다음 슬라이드를 형광 현미경에서 이미지화하기 전에 4°C에 보관할 수 있습니다. 대표적인 이미지가 그림 3에 나와 있습니다.

Results

그림 1: IdU 라벨링 회로도.세포는 두 번의 집단 배가를 위해 IdU로 펄스됩니다. 약물 치료가 필요한 경우, IdU가 있는 상태에서 첫 번째 개체군이 두 배로 증가한 후 투여해야 합니다.

그림 2: IdU, BrdU 또는 CldU로 펄스한 후 얻은 초점 신호 비교.세 가지 다른 티미딘 유사체로 펄스된 세포의 대표 이미지. DAPI, GFP(Alexa-488 레이블 IdU 초점을 나타냄) 및 병합된 채널이 표시됩니다. 기준자: 10 μm.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% 파라포름알데히드(PFA)	피셔 사이언티픽	NC0179595	10g 자당 + 100mL 10X PBS + 물을 925mL로 부피를 만듭니다. 75mL 40% 메탄올 무함유 PFA를 첨가하고 혼합한 후 50mL의 부분 표본을 만든 후 보관 저장 : -20 °C에 보관하십시오
5-요오도-2'-데옥시우리딘(IdU)	시그마 알드리치	I7125-5G	MW = 354.10g/몰. 10mM 스톡의 경우: 3.541mg IdU를 1mL 1N 액체 암모니아에 용해
Anti-BrdU 항체	BD 바이오사이언스	347580	저장 : 4 °C에 보관하십시오
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 2차 항체	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	A32766 (영문	빛에 민감 - 어두운 곳에 보관
소 혈청 알부민(BSA)	시그마 알드리치	A7906-100G	PBS 의 부피에 특정 질량을 추가하여 제작 저장 : 4 °C에 보관하십시오
원형 커버 유리	전자 현미경 과학	72230-01
오브카3	증권 시세	HTB-161	성장 배지: L-글루타민, 0.01mg/mL 소 인슐린이 보충된 RPMI, 최종 농도 20%의 소 태아 혈청 및 1X Pen Strep 저장 : 동결 매체 : 성장 매체 + 5 % DMSO 및 -80 °C에 보관
Poly-L-Lysine 용액	시그마 알드리치	P4832-50ML	저장 : 4 °C에 보관하십시오
DAPI를 사용한 ProLong 다이아몬드 안티페이드 마운턴트	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	P36962	저장 : 4 °C에 보관하십시오
트립신-EDTA, 0.25%	제네시 사이언티픽	25-510	저장 : 4 °C에 보관하십시오
물, 멸균 여과	시그마 알드리치	W3500-6X500ML	저장 : 4 °C에 보관하십시오