Cross-Reactivity-Free Multiplexed Sandwich 면역분석을 위한 Snap Chip 기술

초록

출처: Li, H. et al., 교차 반응성 및 무 스포터 프리 멀티플렉스 샌드위치 면역분석을 위한 Snap Chip.J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 교차 반응성이 없는 멀티플렉스 샌드위치 면역 분석을 위한 스냅 칩 기술의 구현을 보여줍니다. 각각 다른 시약을 포함하는 두 개의 마이크로어레이 슬라이드를 스냅하는 간단한 동작으로 교차 오염 없이 시약 전달을 보장하고 샌드위치 면역 분석을 사용하여 여러 단백질을 검출하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 스냅 칩의 제작 및 보관

1. 단일 전송 방법(그림 1a)
   1. 인산염 완충 식염수(PBS)에 400μg/mL 항체와 20% 글리세롤을 함유한 cAb 용액을 800μm 중심 간 간격으로 60%(각 스폿당 1.2nL)의 상대 습도에서 잉크젯 마이크로어레이 스포터를 사용하여 니트로셀룰로오스(또는 기능성 유리) 분석 슬라이드에 스폿 넣습니다. 슬라이드가 한쪽 모서리에 따라 스포터 데크에 고정되어 있는지 확인합니다(여기서는 왼쪽 하단 모서리가 사용됨).
   2. 상대 습도 60%로 실온에서 1시간 동안 점박이 분석 슬라이드를 배양합니다.
   3. 분석 슬라이드에 16개의 구획이 있는 슬라이드 모듈 개스킷을 고정하여 16개의 웰로 나눕니다. 각 웰에 0.1% Tween-20(PBST)이 포함된 PBS 80μL를 추가하고 셰이커에서 450rpm으로 5회씩 5분씩 흔들어 슬라이드를 세 번 헹굽니다.
   4. 각 웰에 80μL의 차단 용액을 추가하고 450rpm에서 1시간 동안 흔듭니다.
   5. 개스킷을 제거하고 질소 흐름으로 분석 슬라이드를 건조시킵니다.
   6. 스포터 데크에 전송 슬라이드를 고정하고 슬라이드의 왼쪽 하단 모서리를 스포터 데크의 왼쪽 하단 모서리에 대고 밉니다. 잉크젯은 포획 항체(cAbs)와 동일한 레이아웃으로 정렬 표시(폴리스티렌 마이크로 비드 용액)의 배열을 발견합니다.
   7. 정렬 표시를 건조시키십시오. 전사 슬라이드를 뒤집어 스포터 데크에 다시 놓고 왼쪽 하단 모서리에 고정합니다.
   8. 20μg/mL 항체, 20% 글리세롤 및 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 검출 항체(dAb) 스포팅 용액을 준비합니다.
   9. 감시자의 카메라를 사용하여 정렬 표시의 사진을 찍습니다. 이 그림을 스포팅 프로그램에 기준점으로 구현하고 잉크젯 스포터의 이미지 인식 시스템이 왼쪽 상단 표시를 식별하도록 합니다. 해당 좌표를 dAb 어레이의 첫 번째 지점으로 사용합니다. 800μm의 중심 간 간격으로 액적당 8nL를 검출합니다.
2. 이중 전송 방법(그림 1b)
   1. 전사 슬라이드 1을 잉크젯 스포터 데크의 왼쪽 하단 모서리에 놓습니다. PBS에 400μg/mL 항체, 20% 글리세롤 및 1% BSA를 함유한 cAbs 용액을 60%의 상대 습도(각 스폿당 0.4nL 및 직경 ~ 200μm)에서 잉크젯 마이크로어레이 스포터를 사용하여 슬라이드에 스폿합니다. 중심 간 간격은 400μm입니다.
   2. 스냅 장치(그림 2)를 사용하여 니트로셀룰로오스 코팅된(또는 기능화된 유리) 분석 슬라이드로 전사 슬라이드를 스냅하여 cAb 액적을 분석 슬라이드로 이동합니다.
      1. 스냅 장치 측면에 있는 6개의 버튼을 모두 90도 돌려 열린 위치에 있는 모든 플런저를 당기고 잠급니다. 잘린 모서리가 고정된 포고 핀을 향하도록 하여 전사 슬라이드를 소켓의 슬라이드 홀더에 삽입합니다. 세 개의 버튼 중 처음 세트를 돌려 황금색 포고 핀이 있는 플런저를 해제하고 슬라이드가 정렬 핀에 대고 눌렸는지 확인합니다.
      2. 니트로셀룰로오스 코팅된 슬라이드를 4개의 포고 핀에 거꾸로 놓고 스냅 장치에 삽입합니다. 세 개의 버튼으로 구성된 두 번째 세트를 돌려 은색 핀으로 플런저를 해제하고 슬라이드가 정렬 핀에 밀렸는지 확인합니다.
      3. 정확한 위치 지정을 위해 정렬 기둥과 구멍을 사용하여 슬라이드 홀더의 상단 쉘을 배치하여 스냅 장치를 닫습니다.
      4. 닫힌 스냅 장치를 케이지에 삽입하고 닫힘 탭을 완전히 아래로 눌러 적절한 압력을 가하면서 마이크로어레이를 마주 보게 합니다. 1분 동안 닫아 두십시오.
   3. 슬라이드를 분리합니다. 상대 습도 60%로 실온에서 1시간 동안 분석 슬라이드를 배양합니다. 1.1.3 - 1.1.5단계에 설명된 대로 분석 슬라이드를 세척, 차단 및 건조합니다.
   4. 잉크젯 스포터 데크에 다른 전사 슬라이드를 놓고 왼쪽 하단 모서리를 밉니다. PBS에 50 또는 100 μg/mL의 항체(표 1 참조), 20% 글리세롤 및 1% BSA를 함유한 스팟 dAb 용액. 각 스폿이 0.8nL이고 스폿 사이의 중심 간 간격이 400μm인지 확인합니다.
   5. 분석과 전사 슬라이드를 보관합니다. 분석 슬라이드와 전사 슬라이드를 모두 건조제가 들어 있는 밀폐 백에 밀봉하고 -20°C 냉동고에 넣습니다.

2. 스냅 칩을 사용한 다중화 면역분석

1. 냉동실에서 분석 슬라이드를 회수합니다. 슬라이드가 실온에 도달할 때까지 가방을 밀봉한 상태로 30분 동안 두십시오.
2. 0.05% Tween-20을 함유한 PBS에 단백질을 스파이크하여 7점 연속 희석 시료 용액을 준비합니다.
   메모: 여기에서는 5배 희석 계수가 사용됩니다. 각 단백질의 시작 농도는 표 1에 나열되어 있습니다.
3. 적절한 경우 샘플 솔루션을 준비합니다. 예를 들어, PBST 완충액에 인간 혈청을 4회 희석합니다.
4. 분석 슬라이드에 16칸 개스킷을 고정합니다.
5. 8웰 중 1열에 7가지 단백질 희석 용액과 protein-free PBST 완충 용액을 피펫팅으로 채웁니다. 동일한 슬라이드의 다른 8개 웰에 있는 샘플 용액을 피펫팅합니다.
   참고: 80μL 용액을 각 웰에 맞출 수 있습니다. 필요한 경우 추가 샘플을 측정하기 위해 더 많은 슬라이드를 사용할 수 있습니다.
6. 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 450rpm의 셰이커에서 샘플을 배양합니다. 450rpm의 셰이커에서 PBST를 사용하여 슬라이드를 매번 5분씩 세 번 세척합니다. 개스킷을 제거하고 질소 가스 흐름에서 슬라이드를 건조시킵니다.
7. 냉동실에서 dAbs로 전사 슬라이드를 회수합니다. 실온에서 30분 동안 봉지를 밀봉하여 보관하십시오. 그런 다음 재수화를 위해 60% 습도 안정화 비드가 들어 있는 밀폐된 챔버(예: 빈 팁 상자)에서 슬라이드를 20분 동안 배양합니다.
8. 스냅 장치(그림 2)를 사용하여 분석 슬라이드와 함께 전송 슬라이드를 스냅하여 dAb 액적을 전송합니다. 스냅 장치의 작동에 대해서는 섹션 1.2.2를 참조하십시오.
9. 슬라이드를 분리합니다. 60% 습도 안정화 비드가 포함된 밀폐된 챔버에서 1시간 동안 분석 슬라이드를 배양합니다. 분석 슬라이드를 16격실 개스킷으로 고정하고 PBST를 450rpm의 셰이커에서 사용하여 슬라이드를 4회, 5분씩 헹굽니다.
10. PBS에 2.5μg/mL 스트렙타비딘 형광단을 함유한 용액 80μL를 각 웰에 피펫팅합니다. 450rpm의 셰이커에서 20분 동안 배양합니다.
11. PBST로 슬라이드를 3번 헹굽고 450rpm으로 셰이커에 증류수로 한 번 헹굽니다. 개스킷을 제거하고 질소 가스를 사용하여 슬라이드를 건조시킵니다.

3. 슬라이드 스캔 및 데이터 분석

1. 635-nm 레이저를 사용하여 형광 마이크로어레이 스캐너로 분석 슬라이드를 스캔합니다.
2. 분석 소프트웨어(예: array-pro analyzer)를 사용하여 각 스폿의 순 강도를 추출합니다.
3. 통계 소프트웨어를 사용하여 각 단백질의 검출 한계(LOD)를 계산하고 샘플의 단백질 농도를 결정합니다.
   메모: LOD는 3개의 독립적인 분석법의 표준 편차의 3배가 증가한 표준 곡선의 Y-절편으로 정의됩니다.

표 1. 50-plex 분석에서 완충액의 단백질 농도 및 LOD. CA 15-3의 LOD는 U/ml(*) 단위입니다.

명 개 표시기 명 의 의 개 년 년 의 의 의 명 표시기 명 분 명 년 의 표시기 의 의 세 명 시리즈 명 명 명 표시기 명 시리즈 명 명 분 의 의 의 시리즈 명 의 명 명 명 명 의 명 명 명 명 년 의 의 개 분 의 명 의 세 명 명 의 명 분 호 분 명 의 년 의 명

단백질 이름	시작 농도(ng/ml)	LOD (pg/ml)	단백질 이름	시작 농도(ng/ml)	LOD (pg/ml)
앙2	500	1.3 × 104	IL-6b	1	2.1 × 102
증권 시세	500	1.0 × 102	일리노이 -5	50	77
캘리포니아 15-3*	1	4.9 × 103	일리노이 -4	1000	1.5 × 104
세아	1000	5.4 × 103	일리노이 -2	50	76
CXCL10/IP-10	50	1.7 × 102	렙	200	4.0 × 102
증권 시세	200	44	미그	500	11 × 102
(주)이엔지	1000	6.2 × 102	CCL3/밉-1α	50	3.3
증권 시세	50	1.8 × 102	CCL4/MIP-1β	50	12
이그프르	200	1.9 × 102	MMP-3	500	1.0 × 102
FAS-엘	500	4.5 × 102	M-CSF	500	8.2 × 103
증권 시세	500	1.0 × 103	MMP-9	200	3.1 × 102
G-CSF	500	39	CCL2/MCP-1	50	55
GM-CSF	50	3.8	NCAM-1	500	1.7 × 103
그로 α	50	3.0 × 102	β-NGF	200	1.4 × 103
헤르2	500	3.5 × 103	노테토리-3	200	5.8 × 102
PDGF-비비	200	73	오피엔	500	1.9 × 103
IL-1β	500	7.9 × 102	RBP4	200	1.2 ×102
일리노이 - 1ra	200	1.1 × 103	스팍	1000	4.6 ×104
일리노이 - 15	50	8.2 × 102	TNF-α	50	4.4
일리노이-12	1	30	티엔에프-RI	50	1.3 × 102
일리노이 -11	500	1.2 × 103	티엔에프-RII	50	12
일리노이 - 10	500	6.1 ×102	FAS/TNFRSF6	200	2.8 ×102
일리노이 -8	50	6.6	유파	200	24
일리노이 -7	2.5	26	유파(CD87)	200	76
일리노이 -6a	1000	84	베그프	200	6.7 × 102

결과

그림 1. (a) 단일 및 (b) 이중 전달 방법을 비교하는 분석 절차의 개략도.

그림 2. 단일 전송과 이중 전송의 차이점을 보여주는 회로도.(a) 전사 시약의 미러링은 슬라이드와 잉크젯 XY 스테이지 사이의 각도 오정렬을 증폭시킵니다. (b) 이중 전송 방법은 각도 오정렬을 극복합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인산염 완충 식염수 정제	피셔 사이언티픽	5246501개
스트렙타비딘 접합 Cy5	클 랜드	재질 보기 S000-06
트윈-20	시그마-알드리치	p1379
소 혈청 알부민	잭슨 면역 연구소, Inc	TEL.001-000-162
글리세롤	시그마-알드리치	G5516
차단 솔루션: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer	수르모딕스, Inc	SG02
니트로셀룰로오스 코팅 슬라이드	그레이스 바이오 연구소, Inc	305116
아미노실란 코팅 슬라이드	Schott 북미	1064875
스냅 장치	Parallex BioAssays Inc. (파랄렉스 바이오어세이 Inc.)	PBA-SD01
잉크젯 마이크로어레이 감시자	게심	나노 플로터 2.0
슬라이드 모듈 개스킷	그레이스 바이오 연구소, Inc	204862
습도 안정화 구슬	Parallex BioAssays Inc. (파랄렉스 바이오어세이 Inc.)	PBA-HU60
Array-Pro 분석기 소프트웨어	미디어 사이버네틱스	버전 4.5
형광 마이크로어레이 스캐너	애질런트	SureScan Microarray 스캐너
생물 통계 소프트웨어	GraphPad 소프트웨어	GraphPad 프리즘 6
엔도글린 포획 항체	R&D 시스템	MAB10972
엔도글린 단백질	R&D 시스템	1097-KR
엔도글린 검출 항체	R&D 시스템	BAF1097
IL-6a(표 1 참조)	R&D 시스템
IL-6b(표 1 참조)	인비트로젠