검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 첫 번째 항체로 염색
- 크실렌 또는 이와 동등한 시약 3x, 100% 에탄올 2x, 95% 에탄올 1x, 70% 에탄올 1x, 50% 에탄올 1x 및 증류수 2x.
각 단계에 5분이 할당된 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 슬라이드를 드왁스 및 재수화합니다.
메모: 슬라이드는 이 재수화 단계부터 시작하여 최종 단계에서 장착할 때까지 촉촉한 상태를 유지해야 합니다.
- 선택적 항원 회수의 경우 끓는 시트르산나트륨 용액 275mL(10mM, pH = 6.0)에 슬라이드를 8분 동안 놓습니다. 용액을 계속 끓이려면 뚜껑이 있는 14 x 9.5 x 9cm3(W x L x H) 피펫 팁 상자 바닥에 슬라이드를 평평하게 놓고 70W 전자레인지에서 70% 전력으로 용액을 8분 동안 전자레인지에 돌립니다. 그런 다음 전자레인지에서 피펫 팁 상자를 제거하고 뚜껑을 열고 용액을 실온(RT)에서 최소 20분 동안 식힙니다.
- PBST(0.1% 폴리소르베이트 20/80을 함유한 인산염 완충 식염수)가 들어 있는 Coplin jar에 슬라이드를 옮깁니다. PBST로 5분 3회 세척합니다. 다음 단계로 즉시 이동하지 않는 경우 이 단계에서 PBST를 사용하여 슬라이드를 Coplin 용기에 넣고 RT에서 몇 시간 동안 보관하거나 즉시 다음 단계로 이동하지 않는 경우 4°C에서 1-2일 동안 보관합니다.
- 차단 용액을 준비하려면 2차 항체 숙주 종의 일반 혈청을 차단 시약으로 사용합니다. 다른 시판 차단 시약도 사용될 수 있다. 이 연구에서 제시된 연구에 사용된 일반 혈청을 사용하는 경우 PBST 4.9mL에 일반 당나귀 혈청 100μL를 첨가하십시오. 차단 용액은 4°C에서 최대 3일 동안 보관할 수 있습니다.
- 차단의 경우 슬라이드에서 PBST를 털어내고 충분한 차단 용액으로 빠르게 덮습니다. RT에서 슬라이드를 가습 챔버에서 30분 동안 배양합니다.
- 차단 용액을 사용하여 1차 항체 용액(2개의 슬라이드에 대해 500μL)을 준비하여 1차 항체를 원하는 농도로 희석합니다. 용액은 사용할 때까지 얼음에 보관해야 합니다.
- 3β-하이드록시스테로이드 탈수소효소(3βHSD)의 경우 498μL의 차단 용액에 3βHSD 항체 2μL를 추가합니다.
- 티로신 하이드록실라제(TH)의 경우 499μL의 차단 용액에 0.5μL의 TH 항체를 추가합니다.
- β-카테닌의 경우 β-카테닌 항체 1μL를 499μL의 차단 용액에 추가합니다.
- 20α-하이드록시스테로이드 탈수소효소(20αHSD)의 경우 499μL의 차단 용액에 20αHSD 항체 1μL를 추가합니다.
- 사이토크롬 P450 2F2(CYP2F2)의 경우 498μL의 차단 용액에 2μL의 CYP2F2 항체를 추가합니다.
- 슬라이드에서 차단 용액을 털어내고 충분한 1차 항체 용액으로 빠르게 덮어 1차 항체로 배양합니다. 슬라이드를 4°C의 가습된 챔버에서 밤새 배양합니다. 배양하는 동안 슬라이드는 건조를 방지하기 위해 작은 파라핀 필름 조각으로 덮일 수 있습니다.
- 다음날 아침 PBST로 슬라이드를 5분 3회 세척합니다.
- 차단 용액을 사용하여 2차 항체 용액(2개의 슬라이드에 대해 500μL)을 준비하여 비오틴화된 2차 항체를 원하는 농도(예: 1μL의 당나귀 항 마우스 항체 또는 당나귀 항토끼 항체를 499μL의 차단 용액으로)로 희석합니다. 용액은 사용할 때까지 얼음에 보관해야 합니다.
- 슬라이드에서 PBST를 털어내고 충분한 2차 항체 용액으로 빠르게 덮어 두 번째 항체로 배양합니다. 가습 챔버에서 RT.
에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다.
메모: 내인성 비오틴이 우려되는 경우 비오틴화 2차 항체 대신 과산화효소 접합 2차 항체를 사용하십시오. 1.10단계에서 과산화효소 접합 2차 항체를 사용하는 경우 1.14단계로 이동합니다.
- PBST로 슬라이드를 5분 3회 세척합니다.
- 499μL의 PBS에 0.5μL의 SA-HRP를 첨가하여 양고추냉이 과산화효소 접합 스트렙타비딘(SA-HRP) 용액(2개의 슬라이드에 대해 500μL)을 준비합니다. 최종 농도는 1μg/mL입니다.
- SA-HRP 솔루션으로 배양하십시오. 슬라이드에서 PBST를 털어내고 충분한 SA-HRP 용액으로 슬라이드를 빠르게 덮습니다. RT에서 0.5시간 동안 가습된 챔버에서 슬라이드를 배양합니다.
- PBST로 슬라이드를 5분 3회 세척합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 형광단-티라미드를 희석 완충액으로 희석하여 형광단-티라미드 용액을 준비합니다(예: 5μL의 형광단-티라미드를 496μL의 희석 완충액으로).
- 슬라이드에서 PBST를 떨어뜨리고 충분한 형광단-티라미드 용액으로 슬라이드를 빠르게 덮어 플루오로포단-티라미드로 신호 개발을 수행합니다. RT에서 1분 동안 가습된 챔버에서 배양합니다. 원하는 형광 강도를 얻기 위해 배양 시간을 조정할 수 있습니다. PBST가 들어 있는 Coplin jar에 슬라이드를 옮겨 반응을 멈춥니다. PBST로 슬라이드를 3분 2회 세척합니다.
- 이 단계에서 결과를 확인하기 위해 형광 현미경으로 신호를 빠르게 확인할 수 있습니다. 커버슬립을 사용하지 않는 경우 각 섹션에 글리세롤:PBS(1:1) 한 방울을 바르면 샘플이 촉촉하게 유지됩니다. PBST로 슬라이드를 3분 2회 세척합니다. 슬라이드는 다음 단계로 이동하기 전에 4°C의 PBST에 며칠 동안 보관할 수 있습니다.
2. 첫 번째 항체 제거
- 끓는 구연산나트륨 용액 275mL(10mM, pH = 6.0)에 슬라이드를 최소 8분 동안 놓습니다. 뚜껑이 있는 14 x 9.5 x 9cm3(W x L x H) 피펫 팁 상자 바닥에 슬라이드를 평평하게 놓고 700W 전자레인지에서 70% 전력으로 용액을 8분 동안 전자레인지에 돌려 용액을 끓입니다. 더 긴 스트리핑 시간을 선호하는 경우, 슬라이드를 항상 완충 용액에 담근 상태로 유지하기 위해 끓는 구연산나트륨 용액을 사용하여 완충액을 마무리해야 할 수 있습니다. 전자레인지에서 피펫 팁 상자를 제거하고 뚜껑을 연 다음 용액을 상온에서 최소 20분 동안 식힙니다.
- PBST가 들어 있는 Coplin 용기에 슬라이드를 옮깁니다. PBST로 5분 3회 세척합니다. 다음 단계를 즉시 수행하지 않으면 PBST가 있는 Coplin 용기에 슬라이드를 RT에서 몇 시간 동안 보관하거나 4°C에서 1-2일 동안 보관합니다.
3. 두 번째 항체로 염색
- 차단 단계부터 시작하여 1.5단계부터 1.14단계까지 동일한 절차를 따릅니다. 신호 개발 단계(단계 1.15 및 단계 1.16)에서 다른 형광 스펙트럼의 형광단-티라미드를 사용합니다.
메모: 이 방법을 사용하여 슬라이드를 여러 번 벗겨내어 멀티플렉스 염색을 허용할 수 있습니다. 마지막 항체는 리포터로서 플루오로포어-티라마이드를 필요로 하지 않습니다. 형광단 접합 2차 항체를 사용하여 마지막 1차 항체의 신호를 표시할 수 있습니다.
- 핵 카운터 염색이 필요한 경우 RT에서 1분 동안 2 μg/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 Hoechst 용액으로 슬라이드를 배양합니다. 그런 다음 PBST로 슬라이드를 3분 2회 세척합니다.
