동일 숙주 종의 1차 항체를 이용한 멀티플렉스 면역염색 방법

Abstract

출처: Lyu, Q., et al. 마우스 부신의 다중 면역 염색을 위한 전자레인지 및 플루오로포어-티라미드 - 동일한 숙주 종의 접합되지 않은 1차 항체 사용. J. Vis. 특급 (2020).

이 동영상은 동일한 숙주 종의 1차 항체를 사용하여 다중 면역염색을 수행하는 분석을 보여줍니다. 이 방법에서는 부신 조직 절편이 2단계 면역염색 과정을 거칩니다. 처음에는 피질의 마커에 특이적인 항체로 절편을 염색한 다음, 결합된 항체를 벗겨내고 수질의 마커에 특이적인 항체로 다시 염색합니다.

Protocol

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 첫 번째 항체로 염색

1. 크실렌 또는 이와 동등한 시약 3x, 100% 에탄올 2x, 95% 에탄올 1x, 70% 에탄올 1x, 50% 에탄올 1x 및 증류수 2x.
   각 단계에 5분이 할당된 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 슬라이드를 드왁스 및 재수화합니다. 메모: 슬라이드는 이 재수화 단계부터 시작하여 최종 단계에서 장착할 때까지 촉촉한 상태를 유지해야 합니다.
2. 선택적 항원 회수의 경우 끓는 시트르산나트륨 용액 275mL(10mM, pH = 6.0)에 슬라이드를 8분 동안 놓습니다. 용액을 계속 끓이려면 뚜껑이 있는 14 x 9.5 x 9cm³(W x L x H) 피펫 팁 상자 바닥에 슬라이드를 평평하게 놓고 70W 전자레인지에서 70% 전력으로 용액을 8분 동안 전자레인지에 돌립니다. 그런 다음 전자레인지에서 피펫 팁 상자를 제거하고 뚜껑을 열고 용액을 실온(RT)에서 최소 20분 동안 식힙니다.
3. PBST(0.1% 폴리소르베이트 20/80을 함유한 인산염 완충 식염수)가 들어 있는 Coplin jar에 슬라이....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
안티페이드 마운팅 매체	벡터 연구소	H-1000
비오틴화 당나귀 안티 마우스	잭슨이뮤노	Tel.: 715-066-151	1:500 희석
비오틴화 당나귀 안티 토끼	잭슨이뮤노	전화: 711-066-152	1:500 희석
다피	바이오레전드	422801	증류수 중 2μg/mL
형광 현미경	반향	4 회전
양 고추 냉이 과산화 효소 공액 스트렙타비딘	잭슨이뮤노	TEL:016-030-084	1:1000 희석
전자 레인지, 700W	제너럴 일렉트릭	JEM3072DH1BB
마우스 안티 CYP2F2	산타 크루즈,	사우스 캐롤라이나-374540	1:250 희석
마우스 anti-TH	산타 크루즈,	사우스 캐롤라이나-25269	1:1000 희석
일반 당나귀 세럼	잭슨이뮤노	TEL:017-000-121	PBST 2% 혈청
토끼 안티 20αHSD	케라 파스트,	EB4002 (영어	1:500 희석
토끼 안티 3βHSD	트랜스제닉,	KO607	1:250 희석
토끼 안티 TH	노부스,	NB300-109	1:1000 희석
토끼 안티 β-카테닌	아브캠,	ab32572	1:500 희석
스트렙타비딘 서양고추냉이 과산화효소(SA-HRP)	잭슨이뮤노	TEL.016-303-084	1:1000 희석
TSA Cy3 티라마이드	퍼킨엘머	SAT704B001EA	1:100 희석
TSA 플루오레세인 티라마이드	퍼킨엘머	SAT701001EA	1:100 희석