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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 종양 침윤 림프구(TIL)의 현장 면역형광 염색
- 절차 지침
- 실온에서 모든 실험 단계를 수행합니다.
- 모든 단계에서 Tris Buffer Saline(TBS, 재료 표 참조)으로 희석을 수행합니다.
- 1차 항체 배양 후를 제외한 모든 단계에 대해 TBS에서 세척을 수행합니다. 후자의 경우 Tris Buffer Saline Tween20(TBST, 재료 표 참조)을 사용합니다. 버퍼 구성 및 재구성에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
- 항체 배양을 위해 습도 챔버를 사용하고 세척을 위해 염색 용기를 사용하십시오.
- 시술 중에 섹션이 건조되지 않도록 하십시오.
- 전처리
- 조직 샘플이 들어 있는 슬라이드를 해동하고 종이 타월로 표본 주위의 슬라이드를 조심스럽게 말리십시오. 소수성 장벽 펜으로 조직을 포함하는 반응 영역을 구분합니다(재료 표 참조). 2분 동안 건조시킵니다.
- 샘플을 100% 아세톤으로 5분 동안 고정하고 2분 동안 건조시킨 다음 TBS로 10분 동안 세척합니다.
- 채도와 봉쇄
- avidin 0.1% 3방울로 슬라이드를 10분 동안 전처리하고, 슬라이드를 두드리거나 튕겨 avidin을 분배하고 기포를 제거한 다음 비오틴 0.01%(재료 표 참조) 3방울로 10분 동안 처리하고, 두드리거나 튕깁니다. TBS로 세탁하십시오.
- Fc 수용체 차단을 수행합니다. TBS에 희석된 정상 혈청의 5% 부피/부피 100μL를 적용합니다.라벨링된 2차 또는 3차 항체와 동일한 숙주 종의 혈청을 사용합니다(재료 표 참조). 여기에는 당나귀 세럼이 사용되었습니다. 30분 동안 배양합니다.
- 배양 중에 anti-CD8, program cell death protein 1 (PD-1), T 세포 면역 글로불린 및 뮤신 함유 protein-3 (Tim-3) 항체를 간단히 회전시킵니다 (Table of Materials). 표 2에 기재된 바와 같이 TBS에서 1차 항체의 혼합물을 준비합니다.
- CD8, PD-1 및 Tim-3에 대한 면역 염색
- 1차 항체 혼합물을 준비합니다. 사용된 항체(anti-CD8, PD-1, Tim-3 및 이에 상응하는 2차 항체) 및 농도는 Table of Materials 및 Table 2를 참조하십시오.
- 남은 당나귀 세럼을 탭하거나 플릭합니다(1.3.2단계에서 추가). 가습된 챔버에서 1시간 동안 100μL의 라벨링되지 않은 1차 항체 혼합물로 슬라이드를 배양합니다.
- 배양 중에 Cyanine 5 anti-rabbit, Alexa Fluor 488-anti-goat 및 biotinylated anti-mouse 항체를 간단히 회전시키고 표 2에 설명된 대로 2차 항체 혼합물을 준비합니다.
- TBST에서 슬라이드를 5분 동안 세척하고 슬라이드를 건조시킵니다.
- 100 μL의 2차 항체로 슬라이드를 가습된 챔버에서 30분 동안 배양합니다.
- 표 2에 기재된 바와 같이 시아닌 3-스트렙타비딘을 함유하는 3차 항체의 혼합물을 준비합니다.
- TBS에서 10분 동안 슬라이드를 세척하고 슬라이드를 건조시킵니다.
- 슬라이드를 100 μL의 3차 항체 혼합물로 30분 동안 배양합니다.
- TBS에서 10분 동안 슬라이드를 세척하고 슬라이드를 건조시킵니다.
- 셀 장착
- 형광 현미경 검사와 호환되는 커버슬립을 사용하여 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride(DAPI) 함유 장착 매체(1.5μg/mL DAPI)에 슬라이드를 장착합니다(재료 표 참조).
메모: 각 실험에 대한 음성 대조군으로, 해당 항체와 동일한 농도에서 동형이 일치하는 항체가 있는 하나의 슬라이드를 사용했습니다. 이 염색을 위해 마우스 IgG1, 토끼 IgG 및 염소 IgG 음성 대조 항체를 사용했습니다(재료 표 참조). 양성 대조군으로, 우리는 각 실험에 대해 테스트된 마커에 대해 양성으로 알려진 인간 과플라스 편도선을 사용했습니다. 일반적인 염색이 결과에 설명되어 있습니다(그림 1). CD8, PD-1 및 Tim-3의 단일 염색은 DAPI 없이 동일한 전처리로 개별적으로(슬라이드당 1회 염색) 수행해야 합니다. 항체가 없고 DAPI 장착 매체만 있는 동일한 실험 조건에서 슬라이드도 수행해야 합니다. 슬라이드는 항체 및 DAPI 없이 동일한 실험 조건을 사용하여 이미지화해야 합니다.
2. 형광 분석 및 자동 세포 계수
- 자동 현미경을 사용한 이미지 획득
- 프로토콜을 만듭니다.
- 자동 현미경 소프트웨어와 형광 조명기를 켭니다.
- 메뉴 표시줄에서 "파일", "프로토콜 생성"을 클릭하고 "DAPI", "FITC" 및 "TRITC"를 선택합니다.
- "다음", "조직 섹션"을 클릭하고 "다음", "프로토콜 이름"을 클릭합니다.예를 들어 "CD8-PD-1-Tim-3"과 같은 이름을 선택하고 "다음"을 클릭한 다음 "저장"을 클릭합니다.
- 스테이지에 슬라이드를 수동으로 배치합니다.
- 메뉴 표시줄에서 "설정" 및 "설정"을 클릭합니다.새 창에서 "홈 Z 설정"을 클릭합니다.
- 포지티브 컨트롤 슬라이드, 즉 DAPI 샘플로 삼중 염색된 CD8, PD-1 및 Tim-3으로 노출 시간을 조정합니다.
- 컨트롤 표시줄에서 "노출 설정"을 클릭합니다.
- 충분하지만 포화되지 않은 신호를 얻을 때까지 각 필터의 노출 시간을 조정합니다.
- 흑백 이미징의 경우 다음을 수행합니다.
- acquisition을 선택하고 'autofocus'에서 DAPI 필터를 선택합니다.
- "스캔 영역 제한"에서 대물렌즈를 슬라이드의 왼쪽 상단 모서리로 이동합니다. "마크"를 클릭합니다. 오른쪽 하단 모서리에 대해서도 동일한 작업을 수행합니다.
메모: 이 단계는 4X에서 저전력 이미징(LP 이미징) 영역을 구분합니다. 시리즈의 모든 샘플을 둘러싸기 위해 마크를 잘 배치하십시오.
- 고출력(HP) 이미징의 경우 다음을 수행하십시오.
- '자동 초점'에서 'DAPI'를 선택합니다.
- 'Acquisition' 밴드에서 'DAPI', 'FITC', 'Cy3' 및 'Cy5'를 선택합니다. "확인"을 클릭합니다. 메뉴 표시줄에서 "파일" 및 "프로토콜 저장"을 클릭합니다.
- 슬라이드를 스캔합니다.
- 메뉴 표시줄에서 "File" 및 "Load protocol"을 클릭하여 프로토콜을 로드합니다. "시작"을 클릭합니다.
- 'Lab ID'(이미지 저장을 위한 폴더 위치)를 입력합니다. 슬라이드를 식별하기 위해 슬라이드 ID를 입력합니다. "다음"을 클릭합니다.
- "흑백 이미징"을 클릭합니다(명시야 조명 아래에서 전체 슬라이드를 스캔하고 4x 대물렌즈를 사용하여 순차적 이미지를 획득하려면).
메모: 이렇게 하면 슬라이드의 회색 음영 개요가 생성됩니다.
- "표본 찾기"를 클릭합니다. 저해상도(4x)로 스캔할 조직 영역 선택: 'Ctrl' 키를 누른 상태에서 커서를 사용하여 필드를 클릭하여 필드를 선택하거나 선택 취소합니다(그림 2A).
- "LP Imaging"(4x 이미징)을 클릭하면 각 필드의 형광 빨강, 청록, 녹색 이미지를 획득할 수 있습니다.
- HP 필드 선택의 경우 'Ctrl' 키를 누른 상태에서 커서를 사용하여 필드를 클릭하여 고해상도(20x)로 스캔할 조직 영역에 해당하는 필드를 선택하거나 선택 취소합니다. 5개의 필드를 선택합니다(그림 2B).
- "HP Imaging"(20x 이미징)을 클릭하여 각 필드의 다중 스펙트럼 이미지를 획득합니다(그림 2C).
- "데이터 저장소"를 클릭하여 LabID.
에서 시작 부분에서 선택한 폴더에 이미지를 저장합니다.
메모: 이 프로세스는 그림 2에 요약되어 설명되어 있습니다. 각 단계(조직 검출, 필드 선택)에 대해 사용자는 완전 자동화된 스캔 프로세스를 위해 알고리즘을 증가시키고 훈련할 수 있습니다.
표 1: TBS와 TBST의 버퍼 조성. TBS는 항체 혼합물 및 희석액에 사용됩니다. 세척의 경우, TBST가 권장되는 1차 항체 다음에 세척하는 경우를 제외한 모든 단계가 TBS로 수행됩니다.
표시기
| 증권 시세 | 미정 |
| 트리스 - HCl | 0.05 미터 | 0.05 미터 |
| 염화나트륨 | 0.15 미터 | 0.15 미터 |
| 트윈 20 | - | 0.05% |
| 산도 | 7.6 | 7.6 |
| 준비 | 500 mL H2O의 1 정제 |
표 2: CD8-PD-1-Tim-3 면역형광 염색을 위한 상세한 항체 혼합 조성. 각 1차, 2차 및 3차 항체 혼합물에 대해 TBS의 해당 부피에서 수행하기 위한 희석액을 총 1mL의 부피에 대해 제공합니다. 하나의 슬라이드의 경우 총 반응 부피는2cm2의 조직 면적에 대해 100μL입니다.
표시기
표시기
표시기
| 일차 항체의 부피 | 최종 V= 1mL |
| 토끼 안티 CD8 | 마우스 안티 PD-1 | 염소 안티 팀-3 | 증권 시세 |
| 1.6 μL | 2 μL | 30 μL | 966.4 μL |
| 2차 항체의 부피 | |
| 시안 5 안티 토끼 | 비오틴화 안티 마우스 | Alexa Fluor 488 염소 방지 | 증권 시세 |
| 3.3 μL | 2 μL | 2.5 μL | 992.2 |
| 3차 항체의 부피 | |
| Cy3 표지 스트렙타비딘 | | 증권 시세 |
| 3.3 μL | | 996.7 |
