방법 논문

감염된 세포의 바이러스 단백질 국소화를 위한 면역형광 기술

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Samrat, S. K. et al., 면역형광 컨포칼 현미경에 의한 단순 헤르페스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전좌의 시간적 분석.J. Vis. 특급(2018년)

이 비디오는 단순 포진 바이러스-1 감염에서 감염된 세포 단백질 0, ICP0 이동을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. Post-de novo synthesis, ICP0는 핵으로 전위되었다가 나중에 감염이 진행되는 동안 세포질로 이동합니다. 면역형광 현미경 검사는 단백질의 세포 내 국소화를 밝히고 분석하여 감염 단계 전반에 걸친 단백질의 이동에 대한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

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1. 세포 파종 및 바이러스 감염

  1. 바이러스 감염 전 20-24시간에, 인간 배아 폐(HEL) 섬유아세포 또는 기타 세포의 시드 5 x 104를 성장 배지(10% 소 태아 혈청(FBS)가 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM))의 4-웰 11mm 엇갈린 슬라이드에서 검사합니다. 37 ° C에서 5 % 이산화탄소 (CO2) .
    로 세포를 배양합니다. 메모: 각 웰은 감염 시 70-80%의 세포 밀도를 가져야 합니다.
  2. 다음 날, 성장 배지를 제거하고 4-10 pfu/cell 범위의 Medium-199 바이러스로 세포를 감염시킵니다. 바이러스에 감염된 세포를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 기간 동안 슬라이드를 계속 흔듭니다.
  3. 1 h 배양 후 Medium-199를 제거하고 성장 배지를 보충합니다 .
    메모: 다양한 감염 단계를 방해하는 약물은 이 단계에서 또는 바이러스 흡수 전에 추가할 수 있습니다.
  4. 다양한 감염 기간 동안 37°C에서 5% CO2로 바이러스에 감염된 세포를 배양합니다.

2. 고정 및 투과

  1. 적절한 감염 시점에 감염된 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 빠르게 세척하고 PBS에서 갓 제조한 4% 파라포름알데히드 200μL를 첨가합니다. 실온에서 8-10분 동안 파라포름알데히드로 세포를 배양하여 각 웰의 세포를 고정합니다.
  2. 파라포름알데히드를 흡인하고 200μL의 PBS로 웰을 3회 세척합니다. 3차 세척 후 PBS를 완전히 흡인합니다.
  3. 각 웰에 100μL의 0.2% 비이온 계면활성제를 첨가하여 5-10분 동안 세포를 투과시킵니다.
  4. 비이온성 계면활성제를 흡인하고 200μL의 PBS로 웰을 3회 세척합니다.

3. 면역형광 염색

  1. PBS를 완전히 흡인하고 각 웰에 200μL의 차단 완충액(1% 소 혈청 알부민(BSA) 및 PBS의 5% 말 혈청)을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다.
  2. 감염된 세포 단백질 0(토끼 항-ICP0 다클론 항체)에 대해 실험적으로 결정된 1차 항체 농도를 차단 완충액에 추가하고 1차 항체를 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다.
  3. 블로킹 버퍼로 3회 세척하고 10분 배양합니다. Alexa 594-conjugated goat anti-rabbit secondary 항체(차단 완충액에 희석된 1:400)를 추가하고 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 10분 간격으로 블로킹 버퍼로 슬라이드를 3회 세척합니다.
  4. 마지막으로 PBS로 슬라이드를 한 번 세척하여 잔류 BSA와 말 혈청을 제거합니다.
  5. 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)이 있는 페이드 방지 장착 매체 한 방울을 추가하여 슬라이드를 장착하고 투명 매니큐어를 사용하여 커버슬립으로 밀봉합니다.

4. 공초점 이미징

  1. 컨포칼 현미경을 사용하여 Alexa 594의 경우 파장을 590–650nm, DAPI의 경우 410–520nm로 설정합니다. 1024 x 1024 및 라인 평균 8의 이미지 형식을 선택하여 고해상도 이미지를 획득합니다.
  2. 컨포칼 현미경으로 4웰 슬라이드의 각 웰을 분석합니다. 그림 1 및 그림 2와 같이 100X 대물렌즈에서 대표적인 세포 이미지를 획득합니다.
  3. 많은 수의 셀을 계수하려면 40X objective.
    아래에서 연속된 필드의 이미지를 촬영합니다. 메모: 각 감염의 각 시점에서 200개 이상의 감염된 세포를 축적하기 위해 5-10개의 이미지가 필요합니다.
  4. 각 실험에서 비교해야 하는 모든 샘플에 대해 일정한 컨포칼 매개변수를 사용하여 사진을 촬영합니다.

5. 핵 대 세포질 분포 분석

  1. 컨포칼 응용 프로그램 소프트웨어로 프로젝트를 엽니다. ICP0의 핵 대 세포질 분포를 위해 세포를 표로 만들어야 하는 이미지를 선택합니다.
  2. 상단 메뉴에서 "수량" 탭을 클릭하고 도구 메뉴에서 "ROI 정렬"을 선택합니다.
  3. 상단 메뉴에서 "Draw line"을 선택하여 분석할 셀을 가로질러 세로선을 그립니다.
    메모: 히스토그램이 나타나 ICP0 및 DAPI 모두에 대한 라인을 따라 형광 강도를 보여줍니다. 히스토그램에서 파란색 선은 DAPI 픽셀을 나타내며 핵의 경계를 표시하고, 빨간색 선은 ICP0 픽셀을 나타냅니다.
  4. 배경 염색을 기반으로 ICP0 강도에 대한 일정한 임계값을 설정하여 각 실험에서 ICP0 세포 내 분포를 분석합니다.
    1. 그림 2에서 볼 수 있듯이, 평균적으로 적색 신호가 핵 영역에서는 임계값보다 낮지만 파란색 경계를 넘어서는 임계값보다 높으면 빨간색 신호를 주로 세포질에 위치한 것으로 분류합니다.
    2. 빨간색 신호가 핵 전체의 임계값을 초과하고 파란색 신호의 경계를 벗어나는 경우 빨간색 신호를 핵과 세포질 국소화로 그룹화합니다.
    3. 빨간색 신호가 핵의 임계값보다 높지만 평균적으로 파란색 신호의 경계 밖에 있는 경우 빨간색 신호를 핵 국소화로 그룹화합니다.
  5. 서로 다른 감염 시간에 각 샘플에서 200개 이상의 감염된 세포를 표로 만들고 막대 그래프로 표시하여 시간에 따른 ICP0 이동을 보여줍니다(그림 3).

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결과

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그림 1: HSV-1 감염 중 ICP0의 동적 트래피킹.4-웰 슬라이드에서 성장한 HEL 세포는 10 pfu/cell에서 프로토타입 HSV-1(균주 F)에 감염되었습니다. 감염 후 1, 5, 9시간(hpi)에서 세포를 고정, 투과화하고 토끼 항 ICP0 및 마우스 항 PML 1차 항체에 반응한 다음 100X 대물렌즈 미만 이미징을 위해 Alexa 594 복합 항토끼 및 Alexa 488 복합 항 마우스 2차 항체에 반응했습니다. 전골수성 백혈병(PML) 단백질은 ND10 핵체의 표지 단백질로 작용하며, 감염 시 PML 분해로 인해 5 및 9 hpi에서 사라집니다. 눈금 막대 = 10μm.

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
세포 및 바이러스
인간 배아 폐 섬유아세포(HEL 세포)Thomas E. Shenk 박사 (프린스턴 대학교)HEL 세포는 10% FBS가 보충된 DMEM에서 성장했습니다
HSV-1 바이러스 스톡(균주 F)Dr. Bernard Roizman 연구실
보통
Dulbecco의 변형 독수리 매체 (DMEM)인비트로젠 11965-092
소 태아 세럼(FBS)시그마F0926-500ml
중간-199 (10X)지브코제11825-015
시약
4-웰 11mm 비틀 거림 슬라이드Cel-Line/Thermofisher 사이언티픽 30-149H- 블랙
16% 파라포름알데히드 용액(w/v) 메탄올 무함유써모 사이언티픽(Thermo Scientific28908
트리톤 X-100Fisher 시약BP151-1C0
소 혈청 아부민(BSA)칼바이오켐CAS 9048-46-8
호스 세럼시그마H1270
인산염 완충 식염수(PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)Dr. Haidong Gu 연구실
염화나트륨 피셔 바이오시약BP358-212
KH2PO4 피셔 바이오시약BP362-500
케이클 피셔 사이언티픽 BP366-500
나2HPO4 피셔 바이오시약BP332-500
차단 완충액 (1% BSA 및 5% 호스 세럼이 함유된 PBS)Dr. Haidong Gu 연구실
Rabiit Anti-ICP0 항체Dr. Haidong Gu 연구실
PML(PG-M3)-마우스 단클론 IgG산타 크루즈 생명 공학사우스 캐롤라이나-966
Alexa Fluor 594-염소 안티 토끼 IgG인비트로젠A11012
Alexa Fluor 488-goat 안티 마우스 IgG인비트로젠A11001
Vectashield DAPI를 사용한 Mouting 매체벡터 연구소H-1200
파스퇴르 피펫피셔 브랜드13-678-20디
매니큐어샐리 한센
설비
컨포칼 현미경라이카 SP8
컨포칼 소프트웨어Leica LAS X 어플리케이션 제품군
엑셀 소프트웨어마이크로소프트 엑셀
HERAcell 150i CO2 인큐베이터써모 사이언티픽(Thermo Scientific주문 코드 51026282
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