쥐의 폐에 서식하는 선천적 및 적응적 면역 세포를 식별하는 In vitro 방법

초록

출처: Christofides, A., et al. 쥐 폐의 선천성 및 적응 면역 세포 식별을 위한 유세포 분석. J. Vis. Exp. (2021).

이 비디오는 쥐의 폐에 서식하는 면역 세포를 식별하는 체외 기술을 보여줍니다. 쥐의 폐 조직에서 표적 면역 세포를 분리한 후, 선천성 및 적응 면역 세포의 특정 마커에 대해 형광단 표지 항체 칵테일을 사용하여 표면 표지됩니다. 또한 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포는 세포 내 마커를 사용하여 표지됩니다. 그런 다음 유세포 분석을 사용하여 다양한 면역 세포 유형을 식별합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 외과적 절제 및 조직 준비

1. 1mL의 트리브로모에탄올(표준 프로토콜에 따라 제조됨)을 복강내 주사하여 마우스를 안락사시킵니다. 재료 표).
   메모: CO₂ 질식은 폐 손상을 일으키고 폐 면역 세포의 특징과 특성을 변화시킬 수 있으므로 폐 연구에서 피해야 합니다. 경추 탈구는 폐에 기계적 손상을 입힐 수 있으므로 피해야 합니다.
2. 외과 수술을 위해 마우스를 깨끗하고 전용 공간으로 옮깁니다.
3. 생쥐의 등쪽을 아래로 향하게 하여 사지에 바늘이나 테이프를 사용하여 고정합니다. 70% 에탄올을 사용하여 복부 피부의 피부를 소독합니다.
4. 목에서 복부까지 피부를 절개합니다. 흉부 부위의 피부를 조심스럽게 제거합니다.
5. 흉골과 갈비뼈를 조심스럽게 제거합니다.
6. 폐가 완전히 하얗게 될 때까지 18-21G 바늘을 사용하여 10mL의 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)를 우심실에 직접 주입하여 폐를 세척합니다.
7. 폐를 건드리지 않고 흉선과 심장을 조심스럽게 제거합니다.
8. 주변 조직에서 폐를 부드럽게 분리하고 냉소 혈청 알부민(BSA) 완충액이 있는 튜브로 옮깁니다(표 1).
   메모: 단세포 현탁액을 추가로 준비하기 전에 폐에서 인접한 모든 지방을 제거하려는 노력을 기울여야 하는데, 이는 판독값을 편향시킬 수 있기 때문입니다.

2. 단일 세포 현탁액의 준비

1. 폐를 빈 페트리 접시에 옮기고 두 개의 고운 메스로 다집니다. 다진 폐의 모든 조각을 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 5mL의 분해 완충액을 사용하여 플레이트를 세척하고 다진 폐가 들어 있는 50mL 튜브에 추가합니다(표 1).
   메모: 소화 완충액은 사용 직전에 준비해야 합니다. 콜라겐분해효소 5mg/mL를 사용합니다. 1mg 또는 5mg의 콜라겐분해효소를 BSA 완충액 또는 무단백질 PBS와 결합해도 결과가 개선되지 않았습니다(그림 1).
2. 튜브의 뚜껑을 고정하고 37°C에서 150rpm의 속도로 오비탈 셰이커에서 30분 동안 폐를 소화합니다. 10mL의 차가운 BSA 완충액을 첨가하여 반응을 중지합니다.
3. 소화 후 18G 바늘을 사용하여 폐 조각을 섞고 용해합니다. 새 50mL 코니컬 튜브의 맨 위에 70μm 필터 스트레이너를 놓습니다.
   메모: 더 작은 미크론 필터를 사용하면 주요 골수성 개체군이 손실될 수 있습니다.
4. 소화된 폐 혼합물을 스트레이너에 직접 천천히 옮깁니다. 10mL 주사기 플런저의 고무 면을 사용하여 필터에 남아 있는 폐 조각을 부수십시오. BSA 버퍼로 필터에서 처리된 재료를 세척합니다.
5. 단일 셀 현탁액을 350 × g에서 4 °C에서 8분 동안 원심분리합니다.
6. 상등액을 조심스럽게 버리고 1mL의 암모늄-염화물-칼륨(ACK) 용해 완충액에 세포를 재현탁합니다. 1 mL 피펫을 사용하여 잘 섞고 실온에서 90초 동안 배양합니다.
7. 반응을 멈추기 위하여 찬 BSA 완충액의 10 mL를 추가하고 4 °C.Carefully 상등액을 버리고 혈 구계를 사용하여 세포를 세기 위하여 염색 완충기에 있는 펠릿을 염색 완충기에 있는 refuseb.Mudice에 있는 원심 ×분리하기 위하여 반응을 멈추기 위하여 10 mL를 추가하십시오.
8. 세포를 5 × 10⁶ cells/mL의 농도로 재현탁시키고 표면 염색에 사용합니다(섹션 2 참조).
   메모: 이를 위해 96웰 둥근 바닥 플레이트에 세포를 플레이트한 다음 항체를 염색하고 세척합니다. 플레이트 원심분리기를 사용할 수 없는 경우 플레이트 대신 플로우 튜브를 사용하십시오. 이 프로토콜을 사용하면 평균 크기의 6-10주 된 C57BL/6 마우스에서 폐당 ~15-20 × 10⁶ 세포를 얻을 수 있습니다.

3. 표면 항체 염색

1. 96웰 플레이트의 웰당 200μL로 1개 × 10개의⁶개 세포를 전달합니다. 플레이트를 350 × g에서 4 °C에서 7 분 동안 원심 분리하십시오. 그 동안, 염색 완충액에 anti-16/32 항체(1:100)를 희석하여 Fc-block 용액을 준비합니다(표 1).
2. 사전 준비된 Fc 차단 용액(Table of Materials) 50μL에 세포를 재현탁하고 4°C 또는 얼음 위에서 15-20분 동안 배양합니다.
3. 150μL의 염색 완충액을 추가하고 350 × g의 플레이트를 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 한편, 표면 항체를 희석하여 표면 항체 칵테일을 준비합니다(1:100; 표 2) 얼룩 buffer.
   에서 참고: (i) Fc 차단을 위한 항-16/32 항체는 동일한 혼합물의 표면 항체와 함께 사용할 수 있습니다. (ii) 고정성 생존도 염료를 사용하는 경우 1:1,000의 희석으로 표면 항체 칵테일에 첨가합니다.
4. 사전 준비된 표면 항체 칵테일 50 μL에 세포를 재현탁시키고 어두운 곳에서 4 °C에서 30-40분 동안 배양합니다. 염색 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다.
   메모: 세포 내 염색이 필요하지 않은 경우 200μL의 염색 완충액에 세포를 재현탁하고 유세포 분석기에서 데이터 수집을 직접 진행합니다. 또는 나중에 획득하기 위해 셀을 고정하고 4°C에 보관할 수 있습니다. 24시간 이내에 유세포 분석을 위해 세포를 사용하는 것이 좋습니다.

4. 세포 고정 및 세포 내 염색

1. FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set의 고정/투과화 농축액 3부와 고정/투과화 희석제 1부를 혼합하여 고정/투과화 완충액(Fix/Perm Buffer)을 준비합니다(표 1).
2. 섹션 3에 설명된 대로 세포를 도금한 96-well plate의 well당 사전 준비된 Fix/Perm Buffer 50 μL에 세포를 재현탁시키고 어두운 곳에서 4°C에서 20-25분 동안 배양합니다.
3. 10x 투과화 완충액을 정제된 탈이온수에 1:10으로 희석하여 1x 투과화 완충액을 준비합니다.
4. 1x 투과화 완충액으로 세포를 한 번 세척합니다. 한편, 투과화 완충액 1mL에 세포 내 항체(1:100)를 희석하여 세포 내 항체 칵테일을 준비합니다.
5. 96-well plate의 세포당 사전 준비된 표면 항체 칵테일 50μL를 사용하여 세포를 재현탁하고 어두운 곳에서 4°C에서 40분 동안 배양합니다.
6. 투과화 완충액으로 한 번, 염색 완충액으로 한 번 세포를 세척합니다. 최종 세척 후 200μL의 염색 완충액에 세포를 재현탁합니다.
   메모: 플레이트 리더가 있는 유세포 분석기를 사용할 수 없는 경우 세포를 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.
7. 유세포분석기에서 샘플당 최소 1.5 × 10⁶개의 세포를 획득합니다.
   메모: 단색 및 염색되지 않은 대조군 샘플의 경우 샘플당 0.5-1 × 10⁶ 셀로 충분합니다. 최적의 염색을 달성하고 비용을 절감하기 위해 사용되는 개별 항체를 역가하는 것이 좋습니다. 본 프로토콜은 FoxP3 염색 완충액 세트를 사용하여 준비된 Fix/Perm Buffer를 사용하여 최적화되었습니다. CD68은 핵 마커가 아닌 세포질이기 때문에 저농도의 파라포름알데히드 또는 다양한 공급업체의 cytofix/cytoperm 키트와 같은 다른 투과화 용액으로 충분할 수 있습니다.

표 1: 버퍼.

BSA 버퍼	PBS + 0.5% 소 혈청 알부민
소화 완충액	예열된(37°C) BSA 완충액 + 5mg/mL 콜라겐분해효소 유형 1 + 0.2mg/mL DNase I
염색 완충액	PBS + 2.5% FBS
수정/파마 버퍼	Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set의 고정/투과화 희석제의 3부 및 고정/투과화 희석액 1부
투과화 완충액	정제된 탈이온수에 10배 희석된 Foxp3/Transcription Factor staining Buffer Set의 투과화 완충액 10배

표 2: 단클론 항체의 사용.

) 시리즈 발표 ) 의

항원	클론	형광 색소	희석	표면/세포 내
CD45	재질 보기 30-F11	APC/CY7	1:100	표면
GR-1	RB6-8C5	BV421	1:100	표면
CD68	FA-11	퍼CPCy5.5	1:100	세포내
CD11b	엠1/70	PECy7	1:100	표면
시글렉 F	S17007L	FITC (영어	1:100	표면
CD11c	N418	BV650 또는 BV510	1:100	표면
CD64	X54-5/7.1	체육/대즐 594	1:100	표면
MHC-II	엠5/114.15.2	AF700	1:100	표면
CD103	2.00E+07	체육 / FITC	1:100	표면
Live/Dead Fixable Far Read 데드 셀 스테인 키트		퍼레드(APC) 또는 아쿠아(BV510)	1:1000	표면
CD3	17A2	체육	1:100	표면
나220	라3-6B2	AF488	1:100	표면
NK1.1	PK136	FITC (영어	1:100	표면
CD24	30-F1	체육	1:100	표면
메르트	재질 보기 2B10C42	체육	1:100	표면
F4/80	비엠8	BV605	1:100	표면
CX3CR1	SA011F11	체육	1:100	표면
FC블록(CD16/32)	93		1:100	표면

결과

그림 1: 최상의 세포 해리는 예열된 PBS + 0.5% BSA에서 5mg/mL의 콜라겐분해효소 1에 의해 달성됩니다. 모든 다른 조건에서 0.2mg의 DNAse I도 포함되었습니다. 약어: BSA = 소 혈청 알부민; FSC-A = 전방 산란광의 피크 면적; L/D = 살아있는/죽은 염색; SF = 시글렉 F.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10mL 실린지 플런저	엑셀린트	26265
바늘 18g	BD 정밀 글라이드 니들	305165
바늘 21g	BD 정밀 글라이드 니들	305195
50 mL 코니컬 튜브	송골매	3520
70 μm 세포 스트레이너	써모피셔	22363548
96웰 플레이트	팔콘/코닝	3799
ACK 용해 버퍼	써모피셔	A10492-01
안티 마우스 CD11b	바이오레전드	101215	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
안티 마우스 CD11c	바이오레전드	117339 / 117337	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
안티 마우스 CD45	바이오레전드	103115	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
안티 마우스 CD64	바이오레전드	139319	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
안티 마우스 CD68	바이오레전드	137009	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
안티 마우스 GR-1	바이오레전드	108433	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
안티 마우스 Siglec F	바이오레전드	155503	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
아베르틴	시그마-알드리치	240486
나220	바이오레전드	103228	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	9048-46-8
CD103	바이오레전드	121405 / 121419	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
CD24	바이오레전드	138503	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
CD3	바이오레전드	100205	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
원심 분리기
콜라겐분해효소 유형 1	워딩턴 생화학 공사	LS004196
CX3CR1	바이오레전드	149005	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
DNase I	밀리포어 시그마	10104159001
에탄올
F4/80	바이오레전드	123133	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
FC블록(CD16/32)	바이오레전드	101301	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
소 태아 세럼	R&D 시스템
미세한 톱니 모양의 집게	Roboz 수술 기구 Co
Foxp3 / 전사 인자 염색 완충액 세트	써모피셔	전화: 00-5523-00
Futura 안전 메스	메리트 메디컬 시스템(Merit Medical Systems)	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read 데드 셀 스테인 키트	써모피셔	L34973	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
메르트	바이오레전드	151505	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
MHC-II	바이오레전드	107621	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
NK1.1	바이오레전드	108705	자세한 내용은 표 2를 참조하십시오
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