Measuring Macrophage Phagocytic Efficiency with Primaquine and Photodynamic Therapy

초록

이 비디오는 프리마퀸을 사용하여 광역학 치료가 쥐 대식세포 식세포 효율에 미치는 영향을 평가하는 방법을 보여줍니다. 치료되고 감염된 대식세포는 활성산소종을 생성하여 선택적 곰팡이 사멸로 이어지며, 이는 플레이트의 군집이 감소하는 것으로 나타납니다.

프로토콜

1. 크립토코커스 세포의 준비

1. 멸균 효모-맥아-추출물(YM) 한천 플레이트에 접종 루프를 사용하여 테스트 유기체를 줄무늬로 만듭니다.
2. 한천 플레이트를 30°C에서 48시간 동안 배양합니다.
3. 접종 루프를 사용하여 5개의 단일 콜로니를 퍼내고 5mL의 멸균 증류수에 현탁시킵니다.
4. RPMI-1640 배지 mL당 0.5 × 10⁵ 및 2.5 × 10⁵ CFU(Colony Forming Unit) 사이의 세포 농도를 얻기 위해 McFarland 표준물질을 사용하여 세포를 표준화합니다.
5. 100μL 세포 현탁액을 파종된 대식세포가 포함된 마이크로타이터 플레이트의 웰에 분주합니다(아래 섹션 참조).

2. 대식 세포의 준비

1. 20mg/mL 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 20U/mL 페니실린 및 10% 소 태아 혈청이 보충된 10mL의 RPMI-1640 배지가 포함된 조직 플라스크에서 쥐 대식세포 세포주(RAW 264.7)를 배양합니다.
2. 80% 합류가 이루어질 때까지 37°C로 설정된 5% CO₂ 인큐베이터에 플라스크를 놓습니다.
3. 셀 스크레이퍼를 사용하여 셀을 부드럽게 긁어냅니다.
4. 부유 세포를 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
5. 트리판 블루 염색을 사용하여 세포 생존율을 확인합니다.
   메모: 85% 이상의 생존 점수가 선호됩니다.
6. 혈구계를 사용하여 신선하고 멸균된 RPMI-1640 배지의 10mL 용액을 사용하여 대식세포의 세포 농도를 1 × 10⁶ cells/mL로 조정합니다.
7. 100μL의 세포 현탁액을 멸균 96웰 평면 바닥 마이크로타이터 플레이트의 웰에 분배합니다.
8. 37°C.
   의 5% CO₂ 인큐베이터에서 플레이트를 밤새 배양합니다. 메모: 사용하기 전에 하룻밤 동안 사용한 배지를 흡인하고 100μL의 신선한 멸균 Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640) 배지로 교체해야 합니다.

3. 화합물 준비

1. 테스트 광감작제와 프리마퀸(PQ)을 증류수에 용해시켜 원액을 제조합니다.
2. RPMI-1640 매체에서 화합물을 더 희석합니다.
   메모: RPMI-1640 매체의 최종 증류수는 1%를 초과해서는 안 됩니다.
3. 준비된 광감작제의 100μL 용액을 분주하여 원하는 농도를 4배로 이미 파종된 대식세포와 크립토코커스 세포를 포함하는 적절한 웰에 넣습니다.

4. 광역학 치료(PDT) 시행

1. 다음 실험 조건을 설정합니다.
   1. 0μM의 PQ와 2분 동안 암광(DL)에 노출된 세포(즉, 처리되지 않은(non-Rx) 세포)
   2. 6 μM의 세포를 공동 배양하고 2분 동안 DL에 노출(즉, 약물 효과)
   3. 15μM의 PQ를 세포를 공동 배양하고 2분 동안 DL에 노출(즉, 약물 효과)
   4. 30μM의 PQ와 함께 세포를 공동 배양하고 2분 동안 DL에 노출(즉, 약물 효과)
   5. 0μM의 PQ와 함께 2분 동안 자외선(UV)에 노출된 세포(UV 효과)
   6. 6μM의 PQ와 함께 2분 동안 자외선(UVL)에 노출된 세포(즉, PDT 효과)
   7. 15μM의 PQ와 함께 2분 동안 UVL에 노출된 세포(즉, PDT 효과)
   8. 30μM의 PQ와 함께 세포를 공동 배양하고 2분 동안 UVL에 노출(즉, PDT 효과)
      메모: 공동 배양된 세포는 UVL(해당되는 경우)에 노출되기 전에 어두운 곳(해당되는 경우)에서 30분 동안 PQ와 반응하도록 허용해야 합니다.
      메모: 현재 연구에서 PQ의 UV/Vis 흡수율이 260nm이며, 이는 살균 램프의 UV 범위에 속한다는 것을 확인했습니다. 후자의 경우, 우리는 PDT를 구현하기 위해 Class II 생물 안전 캐비닛에 장착된 살균 자외선 C(UVC) 램프를 광원으로 사용했습니다. 램프의 공칭 전력은 30와트인 것으로 보고되었습니다. 세포는 현재 연구에서 램프에서 약 20cm 떨어진 곳에 유지되었습니다. 이 거리에서 램프는 625μW/^cm2의 방사선 출력을 갖는 것으로 추정됩니다.

5. 크립토코컬 세포의 생존을 결정하기 위한 군체 계수

1. 위에 표시된대로 공동 배양 된 세포의 광역학 처리를 시작한 후, 플레이트를 37 ° C에서 5 % CO₂로 18 시간 동안 배양한다.
2. 18시간 후 상층액을 흡인합니다.
3. 200μL의 인산염 완충 용액(PBS)으로 웰을 세척하여 내부화되지 않은 세포를 씻어냅니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
4. 300μL의 0.1% Triton X-100을 웰에 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
5. 웰의 내용물을 흡인하고 멸균 1.5mL 플라스틱 튜브에 분배합니다.
6. 증류수로 세포를 1/10 희석합니다.
   메모: 한천 플레이트에서 30-300 개의 콜로니를 회수 할 수 있도록 희석을 조정하십시오.
7. 희석액 50 μL를 효모 맥아(YM) 한천 플레이트에 피펫팅합니다.
8. 스프레드 플레이트 방법을 사용하여 한천 플레이트 표면에 세포의 합류 잔디를 만듭니다.
9. 플레이트를 30°C에서 48시간 동안 배양합니다.
10. 한천 플레이트에서 발달된 집락 형성 단위(CFU)를 계산합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
한천	머 크		YM 플레이트를 준비하는 데 사용됩니다
효모 추출물	머 크		YM 플레이트를 준비하는 데 사용됩니다
맥아 추출물	머 크		YM 플레이트를 준비하는 데 사용됩니다
펩톤	머 크		YM 플레이트를 준비하는 데 사용됩니다
포도당	머 크		YM 플레이트를 준비하는 데 사용됩니다
트리판 블루 스테인	시그마-알드리치		살아 있는 세포와 죽은 세포를 열거하려면
McFarland 표준	피셔 사이언티픽		셀을 표준화하려면
프리마퀸	머 크		광 감작제로 사용
인산염 완충 용액(PBS)	시그마-알드리치		세포 세척 및 희석
RPMI- 1640 배지	바이오크롬		대식세포를 위한 배양 배지
소 태아 혈청(FBS)	바이오크롬		RPMI-1640 배지를 보충하는 데 사용됩니다.
페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민	시그마-알드리치		RPMI-1640 매체에 추가되었습니다.
0.1% 트리톤 X-100	시그마-알드리치		대식세포를 용해하는 데 사용
96웰 평면 바닥 마이크로타이터 플레이트	Greiner 바이오 원		반응이 운반되는 용기로 사용
티슈 플라스크	라섹		대식세포를 배양하는 데 사용됩니다.
50 mL 원심분리기 튜브	라섹		대식세포를 포함하는 데 사용됩니다.
셀 스크레이퍼	라섹		조직 플라스크에서 대식세포를 분리하는 데 사용됩니다.
접종 루프	라섹		한천 플레이트에 배양을 줄무늬로 만드는 데 사용됩니다.
혈구계	마리엔필드		대식세포의 세포 농도를 결정하기 위해
1.5 mL 플라스틱 튜브	머 크		반응이 운반되는 용기로 사용
자외선	에스코		광감작제의 활성화에 사용
CO2 인큐베이터	써모피셔		대식세포를 배양하는 데 사용됩니다.
클래스 II 생물 안전 캐비닛	에스코		사용자에게 해를 끼치 지 않고 병원체와 안전하게 작업합니다.