아스피린과 이부프로펜이 대식세포의 식세포 능력에 미치는 영향

초록

이 비디오는 pH에 민감한 형광 염료 염색 곰팡이 세포를 사용하여 최소 억제 농도에서 아스피린과 이부프로펜이 대식세포 식세포작용에 미치는 영향을 평가하는 방법을 보여줍니다. 이 약물은 cyclooxygenase-2를 억제하여 프로스타글란딘 형성을 감소시키고 대식세포 식세포작용을 촉진하며, 이는 pH에 민감한 염료의 형광 측정을 통해 관찰됩니다.

프로토콜

1. 안전 고려 사항

1. 직원은 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다.
2. Class II Biological safety 캐비닛에서 병원균 및 대식세포를 처리합니다.

2. 대식 세포의 준비

1. 10mL의 Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640) 배지를 함유하고 20mg/mL 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 20U/mL 페니실린 및 10% 소 태아 혈청(FBS)을 보충하는 조직 플라스크에서 쥐 대식세포 세포주(RAW 264.7)를 배양합니다.
2. 80% 합류가 이루어질 때까지 37°C로 설정된 5% 이산화탄소(CO₂) 인큐베이터에 플라스크를 놓습니다.
3. 셀 스크레이퍼를 사용하여 셀을 부드럽게 긁어냅니다.
4. 부유 세포를 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
5. 트리판 블루 염색을 사용하여 세포 생존력을 측정합니다.
   메모: 85% 이상의 생존 점수가 선호됩니다.
   혈구계를 사용하여 신선한 멸균 RPMI-1640 배지의 10mL 용액을 사용하여 대식세포의 세포 농도를 1 × 10⁵ cells/mL로 조정합니다.100μL의 세포 현탁액을 멸균 96웰 평면 바닥 마이크로타이터 플레이트의 웰에 분배합니다. 37°C.
   의 5% CO₂ 인큐베이터에서 플레이트를 밤새 배양합니다. 메모: 하룻밤 동안 사용한 배지는 사용하기 전에 흡인하고 100μL의 신선한 멸균 RPMI-1640 배지로 교체해야 합니다.

3. 크립토코커스 세포의 준비

1. 멸균 효모-맥아-추출물(YM) 한천 플레이트에 접종 루프를 사용하여 테스트 유기체를 줄무늬로 만듭니다.
2. 한천 플레이트를 30°C에서 48시간 동안 배양합니다.
3. 접종 루프를 사용하여 4% 포도당이 보충된 100mL의 효모 질소 염기(YNB) 육수에 세포 루프를 접종합니다.
4. 30°C에서 160rpm으로 흔들면서 밤새 세포를 성장시킵니다(배양 전).
5. 다음날, 사전 배양 0.1mL를 신선한 YNB 브로스(메인 배양)에 접종하고 세포가 중간 기하급수단계(동일한 배양 조건에서)까지 성장하도록 합니다.
6. 인산염 완충 용액(PBS)으로 세포를 두 번 세척합니다.
7. 혈구계를 사용하여 PBS에서 세포를 1 x 10⁵로 표준화합니다.

4. 식세포작용 염색을 이용한 크립토코커스 세포의 염색

1. 999μL의 셀을 1.5mL 플라스틱 튜브에 분배합니다.
2. 동일한 튜브에 pHrodo green zymosan A 염색 1μL를 추가합니다.
3. 어두운 곳에서 실온에서 1 시간 동안 세포를 천천히 교반하여 염색과 반응하도록 배양합니다.
4. 배양 기간이 끝나면 PBS로 세포를 세 번 씻습니다.
5. 100 μL 세포 현탁액을 파종된 대식세포가 포함된 웰에 분주합니다.

5. 약물 제조

1. 1000mL의 절대 에탄올에 1mg의 아스피린을 사용하여 최종 농도 1000μg/mL까지 스톡 아스피린 용액을 준비합니다.
2. RPMI-1640 배지에서 화합물을 더 희석하여 원하는 약물 농도에 도달합니다.
   메모: RPMI-1640 매체의 최종 에탄올 양은 1%를 초과해서는 안 됩니다. 디메틸 설폭사이드(DMSO) 1000mL에 이부프로펜 1mg을 사용하여 이부프로펜 원액을 준비합니다. RPMI-1640 배지에서 화합물을 더 희석하여 원하는 약물 농도에 도달합니다.
   메모: RPMI-1640 매체의 최종 DMSO 양은 1%를 초과해서는 안 됩니다. 준비된 약물의 100μL 용액을 원하는 농도의 4배로 준비하고 파종된 대식세포와 크립토코커스 세포를 포함하는 적절한 웰에 분주합니다.

6. 대식세포 식작용에 대한 화학민감성제의 효과

1. 화학 감작제, 아스피린 또는 이부프로펜이 있는 상태에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 2시간 또는 6시간 동안 공동 배양된 세포와 함께 플레이트를 배양합니다.
2. 배양 기간이 끝나면 유도 형광을 측정합니다(예: 492nm 및 em: 538nm).
   메모: pHrodo 염색은 식체 내부와 같은 산성 환경에서만 형광을 발합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
한천	머 크		YM 플레이트를 준비하는 데 사용됩니다
효모 추출물	머 크		YM 플레이트를 준비하는 데 사용됩니다
맥아 추출물	머 크		YM 플레이트를 준비하는 데 사용됩니다
펩톤	머 크		YM 플레이트를 준비하는 데 사용됩니다
효모 질소 염기(YNB)	디프코 연구소		크립토코칼 세포의 배양에 사용됩니다.
포도당	머 크		YM 플레이트를 준비하는 데 사용됩니다
트리판 블루 스테인	시그마-알드리치		살아 있는 세포와 죽은 세포를 열거하려면
인산염 완충 용액(PBS)	시그마-알드리치		세포 세척 및 희석
RPMI- 1640 배지	바이오크롬		대식세포를 위한 배양 배지
소 태아 혈청(FBS)	바이오크롬		RPMI-1640 배지를 보충하는 데 사용됩니다.
페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민	시그마-알드리치		RPMI-1640 매체에 추가되었습니다.
pHrodo 그린 zymosan A 얼룩	생명 기술		pH 변화로 인해 내부화된 세포를 염색하는 데 사용됩니다.
아세틸살리실산(아스피린)	시그마-알드리치		검사할 약물
앱솔루트 에탄올	머크		아스피린을 녹이는 데 사용
이부프로펜	시그마-알드리치		검사할 약물
디메틸설폭사이드(DMSO)	머크		이부프로펜을 용해시키는 데 사용됩니다.
96웰 평면 바닥 마이크로타이터 플레이트	Greiner 바이오 원		반응이 운반되는 용기로 사용
티슈 플라스크	라섹		대식세포를 배양하는 데 사용됩니다.
15 mL 원심분리기 튜브	라섹		대식세포를 포함하는 데 사용됩니다.
셀 스크레이퍼	라섹		조직 플라스크에서 대식세포를 분리하는 데 사용됩니다.
접종 루프	라섹		한천 플레이트에 배양을 줄무늬로 만드는 데 사용됩니다.
혈구계	마리엔필드		대식세포의 세포 농도를 결정하기 위해
1.5 mL 플라스틱 튜브	머 크		반응이 운반되는 용기로 사용
EZ Read 800 연구용 분광 광도계	바이오크롬		광학 밀도를 읽으려면
플루오로스칸 어센트 플로리다	써모사이언티픽		형광을 측정하려면
CO2 인큐베이터	써모 피셔		대식세포를 배양하는 데 사용됩니다.
클래스 II 생물 안전 캐비닛	에스코		사용자에게 해를 끼치 지 않고 병원체와 안전하게 작업합니다.