인간 거대세포바이러스의 중화를 측정하기 위한 면역형광 방법

초록

이 동영상은 거대세포바이러스(HCMV)의 중화를 측정하기 위해 고안된 면역형광 분석을 보여줍니다. 바이러스 특이적 항체는 바이러스와 혼합되어 인간 섬유아세포 세포와 함께 배양됩니다. 항체는 바이러스를 중화하여 숙주 세포를 감염시킬 수 없게 만드는 반면, 중화되지 않은 바이러스는 세포를 감염시킵니다. 배양 후, 중화 정도는 면역형광을 사용하여 바이러스에 감염된 세포를 정량화하여 결정됩니다.

프로토콜

1. 감염을 위한 표적 세포의 준비

1. 실험을 수행하기 전날 96웰 플레이트('타겟' 플레이트)에서 타겟 세포를 시딩합니다.
2. 거의 합류(~90%) 단층을 보장하기 위해 웰당 충분한 셀을 플레이트화합니다.
   메모: 이것은 대상 세포 유형의 상대적 크기에 따라 달라집니다. 인간 포피 섬유아세포(HFF)를 사용하는 경우 20,000개의 세포를 잘 파종합니다.
3. 일반적으로 샘플당 21개의 웰(7개 아래 x 3개)을 파종해야 하며, 플레이트당 4개의 샘플을 분석할 수 있습니다.
4. 대조군 역할을 하기 위해 플레이트당 추가로 12개의 웰(즉, 8행)을 파종합니다.

2. 바이러스 준비 : 항체 혼합물

1. 항체와 결합된 90μL의 배지(잘 혼합됨)를 추가하여 새로운 96웰 플레이트('희석' 플레이트)의 1행 1행 3웰에 원하는 초기 테스트 항체 농도의 두 배를 생성합니다.
   메모: 항체의 일반적인 시작 농도는 20μg/mL이지만 경험적으로 측정해야 합니다.
2. 2.1단계에서 3개의 웰 아래에 있는 18개의 웰 각각에 60μL의 매체를 추가합니다(즉, 6개 아래로 x 3개).
3. 60μL의 배지를 12개의 추가 웰(즉, 8행)에 추가합니다.
4. 30μL의 항체 희석액을 1행에서 2행의 해당 웰로 전달합니다.
5. 멀티채널 피펫으로 20회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 2열의 내용물을 혼합합니다.
6. 30μL의 항체 희석액을 2행에서 3행으로 옮깁니다.
7. 7행의 내용이 혼합될 때까지 이 혼합 및 전송 프로세스를 반복합니다.
8. 7행이 혼합되면 7열의 웰에서 30μL를 폐기합니다.
9. 세포에 직접 첨가할 경우 MOI=1 감염을 유발할 수 있는 충분한 감염 입자가 50μL에 포함되도록 HCMV를 완전한 배지로 희석합니다.
   메모: HCMV는 생물안전성 레벨 2(BSL-2) 범주의 병원체입니다. 적절한 안전 절차가 마련되어 있는지 확인하고 모든 HCMV 노출 매체에 대해 필터 팁을 사용하십시오.
   메모: 이를 위해서는 세포/웰과 동일한 수의 감염 입자가 필요하며, 이는 세포 유형과 바이러스 영양에 따라 다릅니다. 위에서 설명한 대로 HFF를 사용하는 경우 필요한 바이러스 농도는 4x10^5pfu/mL.
   입니다. 메모: 희석된 바이러스(예: 10% 추가)를 충분히 과도하게 준비합니다.
10. 항체 희석액이 포함된 모든 웰에 60μL의 희석된 바이러스 스톡을 추가하고, 60μL 배지만 포함된 6개의 웰에 추가합니다.
11. 감염되지 않은 대조군으로 사용하기 위해 나머지 6웰의 배지에만 60μL의 배지만 추가합니다.
12. 생성 된 바이러스를 배양하십시오 : 항체 혼합물을 37^oC에서 1 시간 동안 배양하십시오.

3. 표적 세포의 감염

1. 대상 셀에서 모든 미디어를 제거합니다.
2. 멀티채널 피펫을 사용하여 'dilution' 플레이트에서 100 μL의 바이러스: 항체 혼합물을 'target' 플레이트의 해당 위치에 있는 세포로 전달합니다.
3. 세포를 37 ° C, 5 % CO₂에서 24 시간 동안 배양합니다.

4. 세포의 정착

1. cells.
   에서 모든 미디어를 제거합니다. 메모: 이 시점에서는 우물 간에 팁을 변경할 필요가 없습니다.
2. 모든 웰을 200μL 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고 제거합니다.
3. 모든 웰에 180 μL -20 ^oC, 100% 에탄올을 추가합니다.
4. -20 ^oC에서 최소 30 분 동안 플레이트를 배양하십시오 .
   메모: 증발하기 시작할 때 추가 에탄올이 추가되는 경우 이 단계를 최소 1개월까지 연장할 수 있습니다.
   메모: 플레이트는 이 시점부터 BSL-1 조건에서 안전하게 취급할 수 있으며 필터가 아닌 팁을 사용할 수 있습니다.

5. 면역형광(IF)에 의한 바이러스 감염 세포 검출

1. 플레이트에서 에탄올을 제거합니다.
2. 200μL PBS로 모든 웰을 세척하고 제거합니다.
3. 모든 웰에 200μL PBS를 추가하고 5분 동안 배양합니다.
   1. 한편, PBS에서 1차 항체 희석액을 준비합니다.
   2. 웰당 100μL의 1:2000 마우스 단클론 항-IE가 필요합니다(참고: 희석은 재료에 나열된 특정 항체에 대한 것입니다).
      참고: IF에 사용되는 항체의 희석은 대체 약물을 사용하는 경우 최적화가 필요할 수 있습니다.
   3. 충분한 혼합을 보장하기 위한 와류 혼합물.
4. 모든 웰에서 PBS를 제거하고 100μL 1차 항체 희석액을 추가합니다.
5. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
6. 모든 웰에서 1차 항체를 제거합니다.
7. 200μL PBS를 추가하고 5분 동안 배양합니다.
   1. 한편, PBS에서 2차 항체와 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 희석액을 준비합니다.
   2. 웰당 100μL의 1:2000 형광단 접합 항 마우스 IgG 및 1μg/mL DAPI가 필요합니다.
   3. 참고: IF에 사용되는 2차 항체의 희석은 대체 항체를 사용하는 경우 최적화가 필요할 수 있습니다.
   4. 충분한 혼합을 보장하기 위한 와류 혼합물.
8. 모든 웰에서 PBS를 제거하고 100μL 2차 항체/DAPI 희석을 추가합니다.
9. 빛으로부터 보호되는 실온에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.
10. 모든 웰에서 2차 항체/DAPI를 제거합니다.
11. 200μL PBS로 모든 웰을 세척하고 제거합니다.
12. 모든 웰에 200μL PBS를 추가하고 5분 동안 배양합니다.
13. PBS를 제거하고 모든 웰에 100μL PBS를 추가하고 이미지화할 준비가 될 때까지 4°C에서 빛으로부터 보호하여 보관합니다.
    메모: 플레이트는 신호/이미지 품질의 손실을 최소화하면서 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다.

6. 감염된 세포의 이미징 및 계수

1. 감염을 쉽고 정확하게 정량화하려면 파란색(DAPI, 핵) 및 2차 항체(HCMV 즉시-초기 단백질(IE)) 채널 모두에서 각 웰의 최소 25%를 이미지화합니다.
   메모: IE 면역형광에 의해 생성된 신호는 핵 염색의 신호와 유사해야 하며 이를 확인하기 위해 이미지를 확인해야 합니다.
2. 이 작업은 수동으로 수행할 수 있지만 자동 현미경을 사용하는 것이 좋습니다.
   메모: 배율은 기기에 따라 다르지만, 큰 구조(핵)를 이미징할 때 일반적으로 4X/10X 대물렌즈로 충분합니다.
3. 이미지가 획득되면 선택한 소프트웨어 분석 프로그램을 통해 처리합니다.
   1. 먼저, 존재하는 세포의 수를 계산하기 위해 파란색 채널을 통해 핵을 식별합니다.
   2. 그런 다음 IE는 핵에 국한된 단백질이므로 감염된 세포의 수를 계산하기 위해 이 영역에서만 적색 채널의 신호를 확인해야 합니다.
4. 감염된 세포의 수와 총 세포 수가 계산되면 웰별로 감염 비율을 계산합니다.
5. 이 값은 다른 모든 우물에서 감염되지 않은 우물에서 관찰된 평균 감염 비율을 빼서 백그라운드 검출 수준에 맞게 수정할 수 있습니다.
   메모: 이 수치는 1%보다 훨씬 낮아야 합니다. 1%를 초과하면 해석 절차에 최적화가 필요합니다.
6. 이제 이러한 배경 보정된 값을 원하는 대로 표시, 질의 및 분석할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마우스 단클론 항-IE 항체 클론 6F8.2	밀리포어	MAB8131	면역형광을 위한 1차 항체
토끼 안티 마우스 IgG, Alexa fluor 568 접합 항체	인비트로젠	A-11061	면역형광을 위한 2차 항체
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