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1. MagPlex 마이크로스피어에 대한 포획 항체의 공유 결합
각 포획 항체는 아래 설명된 2단계 절차를 사용하여 특정 카르복실화된 자기 마이크로스피어 세트에 접합됩니다.
참고: 마이크로스피어 커플링에 필요한 모든 시약, 완충액 및 재료가 포함된 커플링 키트도 사용할 수 있습니다(재료 표 참조).
- microspheres와 함께 제공된 제품 정보 시트에 설명된 지침에 따라 stock uncoupled microsphere suspension을 재현탁합니다.
메모: 재현탁 지침은 재고 마이크로스피어 바이알의 크기와 부피에 따라 달라집니다.
- 2.5 x 106의 스톡 마이크로스피어를 권장 마이크로원심분리기 튜브로 옮깁니다(재료 표 참조).
- 튜브를 자기 분리기에 넣고 60초 동안 분리되도록 합니다.
- 튜브를 자기 분리기에 여전히 위치시킨 상태에서 상층액을 제거합니다.
메모: 미세구를 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 와류 및 초음파 처리로 100μL의 dH2O에 20 초 동안 마이크로 스피어를 다시 현탁시킵니다.
- 3단계와 4단계를 반복합니다.
- 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 세척 된 마이크로 스피어 80 μL의 0.1 M 인산 나트륨 모노 염기성, pH 6.2를 와류 및 초음파 처리로 20 초 동안 재현탁시킵니다.
- 10μL의 50mg/mL N-하이드록시설포숙신이미드(sulfo-NHS)(0.1M 인산나트륨 일염기성, pH 6.2로 희석)를 미세구에 넣고 와류로 부드럽게 혼합합니다.
- 50mg/mL 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 염산염(EDC) 10μL(0.1M 인산나트륨 일염기성, pH 6.2로 희석)를 미세구에 넣고 소용돌이에 의해 부드럽게 혼합합니다.
- 실온에서 20분 동안 배양하고 10분 간격으로 소용돌이에 의해 부드럽게 혼합합니다.
- 튜브를 자기 분리기에 넣고 60초 동안 분리되도록 합니다.
- 튜브를 자기 분리기에 여전히 위치시킨 상태에서 상층액을 제거합니다.
메모: 미세구를 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 약 20초 동안 와류 및 초음파 처리에 의해 pH 7.4의 250μL 인산염 완충 식염수(PBS)에 미세구를 재현탁합니다.
- 튜브를 자기 분리기에 넣고 60초 동안 분리되도록 합니다.
- 튜브를 자기 분리기에 여전히 위치시킨 상태에서 상층액을 제거합니다.
메모: 미세구를 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 13-15단계를 반복하여 총 두 번 세탁합니다.
- 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 활성화 및 세척된 미세구를 100μL의 PBS, pH 7.4에서 와류 및 초음파 처리에 의해 약 20초 동안 재현탁합니다.
- 재현탁된 마이크로스피어(즉, 5μg/100만 마이크로스피어)에 12.5μg의 포획 항체를 추가합니다.
메모: 포획을 위해 단클론 항체가 선호되지만 다클론 항체도 사용할 수 있습니다.
참고: 100만 개의 비드당 5μg 단백질이 일반적으로 우수한 성능을 발휘하지만 최적의 분석 성능을 얻으려면 양을 적정하는 것이 좋습니다.
- PBS, pH 7.4로 총 부피를 500μL로 가져옵니다.
- 와류에 의한 커플링 반응을 혼합합니다.
- 어두운 곳에서 실온에서 회전하여 혼합하여 2시간 동안 배양합니다.
- 튜브를 자기 분리기에 넣고 60초 동안 분리되도록 합니다.
- 튜브를 여전히 자기 분리기에 위치시킨 상태에서 상층액을 제거합니다.
메모: 미세구를 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 결합 된 마이크로 스피어를 1ml의 PBS, pH 7.4에 재현탁 0.02 % Tween-20, 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.05 % 아지드 나트륨 (PBS-TBN)을 와류 및 초음파 처리에 의해 20 초 동안 재현 탁시킵니다.
- 튜브를 자기 분리기에 넣고 60초 동안 분리되도록 합니다.
- 튜브를 자기 분리기에 여전히 위치시킨 상태에서 상층액을 제거합니다.
메모: 미세구를 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 24-26단계를 반복하여 총 두 번 세탁합니다.
- 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 결합된 마이크로스피어를 500μL의 PBS-TBN.
에 재현탁합니다.
메모: 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 회수된 미세구의 수를 결정합니다.
- 결합된 마이크로스피어는 어두운 곳에서 2-8°C로 냉장 보관합니다.
메모: 커플링 효율을 확인하기 위한 프로토콜도 사용할 수 있습니다.
2. 검출 항체의 비오틴 라벨링
- 검출 항체는 항체 분자당 4-6개의 비오틴 그룹을 달성하기 위해 제조업체의 지침에 따라 20배 몰 초과의 비오틴 시약과 함께 EZ-Link sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido) hexanoate를 사용하여 비오틴 라벨링되었습니다.
메모: 일반적으로 검출에는 다클론 항체가 사용되지만, 포획 항체와 다른 에피토프에 특이적인 경우 단클론 항체도 사용할 수 있습니다.
메모: 대안적으로, 시판되는 비오틴화 항체가 검출을 위해 사용될 수 있습니다.
3. Multiplexed Capture Sandwich Immunoassay에 의한 유기체 검출
위의 1과 2에서 생성된 결합 마이크로스피어 세트와 표지된 검출 항체는 샘플에 존재하는 박테리아를 검출하고 정량화하기 위해 멀티플렉스 포획 샌드위치 면역분석에 사용됩니다. 분석 워크플로우의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.
- 항체 결합 MagPlex 비드 세트의 기성 바이알을 2-8ºC 보관에서 선택하십시오.
- 20초 동안 소용돌이치고 초음파 처리합니다.
- 각 비드 세트가 PBS-TBN.
에서 각 반응 웰(50,000 비드/세트/ml)에 대해 50μL당 2500 마이크로구의 최종 농도가 되도록 작업 멀티플렉스 비드 혼합물을 준비합니다.
메모: 스프레드시트를 사용하여 작업 비드 혼합물에 대한 준비 매개변수를 결정합니다.
메모: 분석 및 기기 성능을 모니터링하기 위해 내부 대조 비드(RP1 모니터 마이크로스피어)도 포함될 수 있습니다.
- 50 μL의 작업 비드 혼합물을 96웰 플레이트의 적절한 웰에 피펫팅합니다.
- 50 μL의 표준물질 또는 샘플을 적절한 웰에 피펫팅합니다.
- 50μL의 PBS-TBN을 각 배경 웰에 피펫팅합니다.
- 비드를 빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 호일 씰로 덮고 800rpm으로 흔들면서 실온의 플레이트 셰이커에서 1시간 동안 배양합니다.
- 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 1분 동안 놓습니다.
- 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 유지하고 호일을 조심스럽게 제거하고 플레이트를 뒤집어 우물을 비운 다음 두꺼운 실험실 종이 타월 층을 3-4회 두드려 건조시킵니다.
메모: 또는 다중 채널 피펫터를 사용하여 웰을 수동으로 흡입하거나 자동 플레이트 세척기를 사용합니다.
- 멀티채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 200μL의 PBS-TBN을 추가하고 800rpm의 플레이트 셰이커에서 1분 동안 흔듭니다.
- 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 1분 동안 놓습니다.
- 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 유지하고 플레이트를 뒤집어 우물을 비운 다음 두꺼운 실험실 종이 타월 층을 3-4회 두드려 건조시킵니다.
메모: 또는 다중 채널 피펫터를 사용하여 웰을 수동으로 흡입하거나 자동 플레이트 세척기를 사용합니다.
- 10-12단계를 반복하여 총 두 번의 세척을 수행합니다.
메모: 반응의 잠재적인 희석을 방지하기 위해 다음 단계로 진행하기 전에 가능한 한 많은 버퍼를 제거하십시오.
- 멀티채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 50μL의 분석 버퍼를 추가하고 800rpm의 플레이트 셰이커에서 1분 동안 흔듭니다.
- 비오틴화된 검출 항체를 PBS-TBN에서 4 μg/ml로 희석합니다.
- 각 웰에 희석된 검출 항체 50μL를 추가합니다.
- 비드를 빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 호일 씰로 덮고 800rpm으로 흔들면서 실온의 플레이트 셰이커에서 1시간 동안 배양합니다.
- 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 1분 동안 놓습니다.
- 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 유지하고 플레이트를 뒤집어 우물을 비운 다음 두꺼운 실험실 종이 타월 층을 3-4회 두드려 건조시킵니다.
메모: 또는 다중 채널 피펫터를 사용하여 웰을 수동으로 흡입하거나 자동 플레이트 세척기를 사용합니다.
- 10-12.
단계에 설명된 절차에 따라 각 우물을 두 번 세척합니다.
메모: 반응의 잠재적인 희석을 방지하기 위해 다음 단계로 진행하기 전에 가능한 한 많은 버퍼를 제거하십시오.
- 멀티채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 50μL의 분석 버퍼를 추가하고 800rpm의 플레이트 셰이커에서 1분 동안 흔듭니다. 스트렙타비딘, R-피코에리트린 접합체(SAPE).
- 분석 버퍼에서 SAPE 리포터를 4μg/mL로 희석합니다.
- 각 웰에 희석된 SAPE 50μL를 추가합니다.
- 플레이트를 호일 씰로 덮어 비드와 SAPE를 빛으로부터 보호하고 800rpm으로 흔들면서 실온의 플레이트 셰이커에서 30분 동안 배양합니다.
- 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 1분 동안 놓습니다.
- 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 유지하고 플레이트를 뒤집어 우물을 비운 다음 두꺼운 실험실 종이 타월 층을 3-4회 두드려 건조시킵니다.
참고: 또는 다중 채널 피펫터를 사용하여 웰을 수동으로 흡입하거나 자동화된 플레이트 세척기를 사용하십시오.
- 10-12단계에 설명된 절차에 따라 각 우물을 두 번 세척합니다.
- 각 웰에 PBS-TBN 100μL를 추가하고 플레이트 셰이커에서 800rpm으로 1분 동안 흔듭니다.
- Luminex 분석기에서 각 반응의 50 μL를 분석하고(사용된 분석기의 사용자 설명서에 따름) 분석을 위해 비드 세트당 최소 50개의 비드를 수집합니다. xMAP INTELLIFLEX®에 대한 간략한 설명은 다음과 같습니다.
- 화면의 왼쪽 상단 모서리에 있는 드롭다운 메뉴를 선택하고 Plate Configuration(플레이트 구성)으로 이동합니다.
- 런 플레이트를 선택합니다.
- 꺼내기 아이콘을 선택하여 플레이트 캐리어를 꺼냅니다.
- 플레이트를 플레이트 캐리어에 로드하고 Retract(후퇴) 아이콘을 선택하여 플레이트 캐리어를 후퇴시킵니다.
- 실행 아이콘을 선택하여 플레이트를 실행합니다.
