호중구 단백질의 분리 및 소화(Isolation and Digestion of Neutrophil Proteins)

초록

이 비디오는 호중구에서 단백질을 분리하여 추가로 처리되어 더 작은 펩타이드로 소화되는 과정을 보여줍니다. 이러한 펩타이드는 향후 분석에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 호중구 세포 수집 및 용해

1. 400 x g에서 5분 동안 시료를 원심분리하여 15mL 튜브에서 호중구 분화된 HL60 세포를 수집합니다.
   메모: 호중구는 분화 후 3.5 x 10⁵ cells/mL의 포화도에 있어야 합니다.총 단백질체 추출을 위해 약 500만 개의 세포를 수확합니다.
2. 상등액을 버리고 15mL의 인산염 완충 용액(PBS)을 튜브에 추가합니다.
3. 400 x g에서 5분 동안 원심분리기 시료 주입
4. 1.2-1.3단계를 반복합니다.
   메모: 세포 샘플은 액체 질소로 급속 냉동하고 실험 기간에 따라 1.4단계 후에 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
5. 각 샘플에 단백질분해효소 억제제 칵테일(PIC) 정제를 포함하는 차가운 100mM Tris(하이드록시메틸) 아미노메탄 염산염(Tris-HCl) pH 8.5 300μl를 추가합니다.
6. Vortex는 간략하게 샘플링합니다.
7. 2% SDS의 최종 농도에 20% SDS의 1/10 부피를 추가합니다.
8. 세포 샘플을 용해하려면 10% 전력으로 30초 동안 켜고 30초 동안 5주기 동안 얼음 수조에서 샘플을 초음파 처리합니다.
9. 짧은 회전으로 원심분리기 샘플(최대 속도 5-10초).
   메모: 세포 파편이 펠릿이 되지 않도록 하십시오. 짧은 스핀을 사용하여 튜브 벽에서 스프레이를 수집합니다.
10. 15 mL 튜브에서 2 mL 튜브로 샘플을 옮깁니다.
11. 1M 스톡 디티오트레이톨(DTT)의 1/10 부피를 10mM DTT의 최종 농도에 추가합니다.
12. Vortex는 간략하게 샘플링합니다.
13. 95°C에서 800rpm으로 흔들면서 10분 동안 샘플을 배양합니다.
14. 10분 후 샘플을 실온으로 식히십시오.
    메모: 냉각 과정을 가속화하기 위해 샘플을 얼음에 넣을 수 있습니다.
15. 0.55mM 요오드아세트아미드(IAA)의 1/10 부피를 55mM IAA의 최종 농도에 추가합니다.
    메모: IAA가 빛에 노출되지 않도록 어두운 곳에서 1.15단계를 수행합니다.
16. Vortex는 간략하게 샘플링합니다.
17. 어두운 곳에서 20분 동안 실온에서 샘플을 배양합니다.
18. 최종 농도 80%에서 100% 얼음처럼 차가운 아세톤을 추가하고 샘플을 -20°C에서 밤새 보관합니다.
    메모: 필요한 경우 -20°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.

2. 호중구 단백질의 소화

1. 13,500rpm, 4°C에서 10분 동안 원심분리기 시료를 추출하여 세포 펠릿을 침전시킵니다.
2. 상층액을 버리고 500μl의 80% 얼음처럼 차가운 아세톤으로 셀 펠릿을 세척합니다.
3. 13,500rpm, 4°C에서 10분 동안 원심분리기 시료를 추출하고 상층액을 제거합니다.
4. 2.1-2.3단계를 반복합니다.
5. 공기 건조 펠릿.
6. 건조되면 100 μl의 8 M Urea / 40 mM 4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES)을 세포 펠렛에 첨가하고 4 ° C 수조에서 30 초 동안 켜고 끄고, 15 사이클 동안 단백질 펠릿을 재용해시킵니다.
7. 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 트립토판 분석(또는 이에 상응하는 분석)은 제조업체의 지침에 따라 단백질 농도를 정량화합니다.
8. 300μl의 중탄산암모늄(ABC)을 첨가하여 시료를 2M 요소의 최종 농도로 희석합니다.
9. 50 μg의 단백질을 소화하기 위해 얼음 위의 샘플에 1:50 Trypsin/LysC(효소 대 단백질 비율)를 첨가하고 부드럽게 두드려 샘플을 혼합합니다.
10. 분해를 수행하기 위해 밤새 실온에서 샘플을 배양합니다.

결과

그림 1. 질량 분석 기반 단백질체학 프로파일링을 위해 호중구로 분화된 HL60 세포의 워크플로우. 미분화 및 분화(DMSO 화학적 자극을 통해) HL60 세포주를 배양, 수집 및 처리하여 총 단백질체 추출을 수행했습니다. 단백질은 Trypsin/LysC로 절단하고, 펩타이드는 C18 STAGE-tips를 사용하여 정제한 후 LC-MS/MS에 의해 검출했습니다.MaxQuant 및 Perseus는 데이터 분석에 사용되었습니다. Biorender.com 로 생성된 Figure

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15ml 팔콘 튜브	폭스바겐	제470225-000
25 mL 혈청학적	피셔 사이언티픽	14955235
중탄산암모늄(ABC)	써모피셔 사이언티픽	A643-500
아세톤	시그마 알드리치	34850-1L
BSA 분석 키트	폭스바겐	CA62408-940
원심분리기 5810 R	시그마 알드리치	EP022628188
디티오트레이톨(DTT)	써모피셔 사이언티픽	R0861	1M 분취액을 준비하고 -20°C에서 보관
소 태아 세럼(FBS)	써모피셔 사이언티픽	12483020	해동하고 부분 표본을 준비하여 -20°C에서 보관
가열 블록
헤페스	시그마 알드리치	H3375 (영문	8M 요소 / 40m HEPES 부분 표본을 준비하고 -20 ° C에서 보관하십시오
요오도아세트아미드(IAA)	피셔 사이언티픽	AAA1471514	0.55M 분취액을 준비하고 -20°C에서 보관하십시오.빛 노출을 피하십시오
L-글루타민	피셔 사이언티픽	25030081	해동하고 부분 표본을 준비하여 -20°C에서 보관
액체 질소
LoBind 마이크로 원심분리기 튜브	에펜도르프	13-698-794
페니실린 스트렙토마이신, 암포테리신	시그마 알드리치	A5955	해동하고 부분 표본을 준비하여 -20°C에서 보관
호중구 분화 HL60 세포
인산염 완충 용액(PBS)	바이오샵	PBS408	실온에서 보관
프로브 초음파 처리기	피셔 사이언티픽	Tel.: 100-132-894
프로테아제 억제제 칵테일(PIC) 정제	시그마 알드리치	5892791001	4°C에서 보관
RPMI 1640	써모피셔 사이언티픽	11875093	4°C에서 보관
나트륨 도데 실 황산염 (SDS)	써모피셔 사이언티픽	J18220입니다. 답1	2% SDS 솔루션 준비
SpeedVac 원심분리기	에펜도르프	07-748-15
T75 플라스크	써모피셔 사이언티픽	156499
트리스 HCL pH 8.5	피셔 사이언티픽	BP152-1	4°C에서 보관
초음파 수조	폭스바겐	97043-960
요소	바이오샵	URE001.1

호 ) . . 시리즈 년 (영문)