펩타이드의 탈염 및 정제를 위한 STAGE 팁 절차

초록

이 동영상은 STAGE Tip 절차를 통한 펩타이드 정제를 보여줍니다. 긴 탄화수소 사슬에 결합된 수지 비드를 포함하는 소형 컬럼은 소수성 상호 작용 기반 정제를 용이하게 합니다. 미리 분해된 펩타이드 샘플을 컬럼에 로드하면 펩타이드 단편이 수지 비드에 결합하여 불순물이 통과할 수 있습니다. 소수성 상호작용을 방해하는 용리 완충액이 적용되어 펩타이드 단편을 용리시킵니다.

프로토콜

1. 펩타이드의 정제 및 탈염

1. 각 펩타이드 샘플에 대해 200μl 피펫 팁에 3개의 C18 수지 층을 포장하여 STop And Go Extraction(STAGE) 팁을 구성합니다.
2. 샘플에 1/10 정지 용액(20% 아세토니트릴[ACN]] 및 6% 트리플루오로아세트산[TFA])을 추가합니다.
3. 10분 동안 13,200rpm에서 펠릿 침전을 위한 원심분리기 샘플.
4. 상등액을 새 2mL 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.
5. 100μl의 100% ACN으로 스테이지 팁을 세척합니다.
6. 1000 x g에서 2분 동안 원심분리기 STAGE 팁
   메모: 원심분리기 STAGE 모든 액체가 C18 수지를 통과할 때까지 기울입니다.
7. STAGE 팁을 50μl 버퍼 B(80% ACN, 0.5% 아세트산 및 ddH_2O)로 세척합니다.
8. 원심분리기 STAGE 팁 1000 x g에서 2분 동안
9. 세척STAGE 팁을 200μl 버퍼 A(2% ACN, 0.1% TFA, 0.5% 아세트산 및 ddH₂O)로 합니다.
10. 원심분리기 스테이지 팁, 1000 x g에서 2분 동안
11. 샘플을 STAGE 팁에 로드합니다.
12. 1000 x g에서 3-5분 동안 원심분리기 시료
13. STAGE 팁을 200μl 버퍼 A로 세척합니다.
14. 1000 x g에서 3-5분 동안 원심분리기
15. 각 STAGE 팁에 50μl의 버퍼 B를 추가합니다
.
16. 주사기를 사용하여 Buffer B가 포함된 샘플을 0.2mL PCR 스트립 튜브로 용리합니다.
17. 샘플이 용리되면 진공 원심분리기를 사용하여 펩타이드를 45분 동안 건조시킵니다.
18. 샘플이 건조되면 MS.
    까지 실온에 보관하십시오. 메모: 펩타이드를 2주 이상 보관해야 하는 경우 -20°C에서 보관하는 것이 좋습니다.
19. 고분해능 질량분석법(MS)에서 시료를 실행합니다.
    메모: 시료 측정 매개변수(예: 로드된 시료의 양, 액체 크로마토그래피 구배 길이, 분리능)는 사용된 기기에 따라 다릅니다.

2. 호중구의 단백질체 프로파일링

1. 원시 데이터 처리
   1. MS에서 얻은 원시 데이터 파일을 MaxQuant에 업로드합니다.
   2. 이 소프트웨어는 상향식(bottom-up), 데이터 종속 수집 파일로 실행되도록 설계되었으며, 많은 기본 파라미터가 이러한 샘플에 최적화되어 있습니다. 기본 매개변수에는 소화(트립신 P), 메티오닌 산화(산화(M)) 및 단백질의 N-아세틸화(아세틸(단백질 N-term))의 다양한 변형, 시스테인의 카르바미도메틸화(카바미도메틸(C))의 고정 수정이 포함됩니다.
   3. 이러한 파라미터에 대한 조정에는 label-free 정량화(LFQ, 최소 비율 수를 1로 설정), Run 간 일치(즉, on/off) 및 단백질당 식별된 최소 펩타이드 수(2로 설정 권장)가 포함됩니다.
   4. 전역 매개변수에서 시퀀스 식별을 위해 FASTA 파일을 가져옵니다. 이 실험을 위해 Uniprot 데이터베이스의 Homo sapiens (Human) (UP000005640) FASTA 파일을 사용했습니다. 메모: 기록 보관을 위해 다음 정보를 기록하십시오: 생물 ID = 9606; 단백질의 수 = 79,740; 파일 다운로드 날짜입니다.
   5. 처리에 사용할 컴퓨터 코어 수를 설정하고 시작을 선택합니다.
   6. MaxQuant가 완료되면 다른 파일과 함께 '결합된' 폴더가 생성됩니다.
      메모: 다른 파일은 펩타이드, 변형 등을 식별하는 데 사용할 수 있으며, PRIDE(Proteome Xchange)를 포함한 데이터 저장소에 전체 데이터 세트를 업로드하는 데 필요할 수 있습니다.
2. Perseus의 데이터 분석 및 시각화
   1. Perseus에 'proteingroups.txt'를 업로드하고 'Main' 창에 대한 모든 LFQ 강도 파일을 선택합니다.
      메모: 기준선 정보는 Perseus 창으로 직접 가져오지만 다른 정보(예: 수정 사이트)는 수동으로 추가해야 할 수 있습니다.
   2. 오염 물질, 역펩타이드 및 부위별로만 식별된 펩타이드를 제거하여 행을 필터링합니다.
   3. 로그₂(x)를 기준으로 데이터를 변환합니다.
   4. 각 반복실험에서 검출된 단백질의 수를 관찰하려면 숫자형 벤 다이어그램을 구성합니다.
   5. 각 샘플에 대한 범주 주석을 설정합니다.
      메모: 통계적 목적을 위해 하나의 생물학적 샘플에 대한 모든 반복실험은 동일한 이름을 가져야 합니다.
   6. 반복 실험의 >50%에서 단백질이 식별되고 하나 이상의 그룹 내에서 식별된 유효한 값을 기반으로 행을 필터링합니다.
      메모: 유효한 값별 필터링은 실험 설정 및 목표에 따라 더 엄격할 수 있습니다(예: 모든 샘플에 단백질이 존재해야 함).
   7. LFQ의 결측값을 바꾸기 위해 정규 분포의 대치를 수행할 수 있습니다.
      참고: 기본 매개변수는 LFQ 데이터에 최적화되어 있지만 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
   8. 단백질 행에 주석 정보를 추가합니다. txt.gz FASTA 파일(Perseus 웹 사이트에서 가져옴)을 'bin', 'conf' 및 'annotation' 폴더에 추가하고 특정 용어(예: 단백질 이름, 유전자 이름, 유전자 온톨로지)를 가져옵니다.
   9. 이제 매트릭스가 완성되었으며 테스트된 조건 간의 단백질 함량의 유의미한 변화를 결정하기 위해 통계 테스트(예: ANOVA, t-테스트)에 사용할 수 있습니다. 시각화 도구의 다른 형태로는 주성분 분석 플롯, 히트 맵 및 범주 보강이 있습니다.
      메모: 주석 정보는 UniProt에서 다운로드하여 Perseus 프레임워크에 통합할 수도 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15ml 팔콘 튜브	폭스바겐	제470225-000
25 mL 혈청학적	피셔 사이언티픽	14955235
중탄산암모늄(ABC)	써모피셔 사이언티픽	A643-500
아세트산	시그마 알드리치	1099510001
아세톤	시그마 알드리치	34850-1L
아세토니트릴(ACN), MS 등급	뚫다	TS-51101
BSA 분석 키트	폭스바겐	CA62408-940
C18 디스크(STAGE 팁)	피셔 사이언티픽	13110019
원심분리기 5810 R	시그마 알드리치	EP022628188
디티오트레이톨(DTT)	써모피셔 사이언티픽	R0861	1M 분취액을 준비하고 -20°C에서 보관
소 태아 세럼(FBS)	써모피셔 사이언티픽	12483020	해동하고 부분 표본을 준비하여 -20°C에서 보관
헤페스	시그마 알드리치	H3375 (영문	8M 요소 / 40m HEPES 부분 표본을 준비하고 -20 ° C에서 보관하십시오
고분해능 질량 분석기	써모피셔 사이언티픽	726042
요오도아세트아미드(IAA)	피셔 사이언티픽	AAA1471514	0.55M 분취액을 준비하고 -20°C에서 보관하십시오.빛 노출을 피하십시오
L-글루타민	피셔 사이언티픽	25030081	해동하고 부분 표본을 준비하여 -20°C에서 보관
LoBind 마이크로 원심분리기 튜브	에펜도르프	13-698-794
맥스퀀트	https://www.maxquant.org/
PCR 스트립 튜브	폭스바겐	제76318-802
페니실린 스트렙토마이신, 암포테리신	시그마 알드리치	A5955	해동하고 부분 표본을 준비하여 -20°C에서 보관
페르세우스자리	https://www.maxquant.org/Perseus/
인산염 완충 용액(PBS)	바이오샵	PBS408	실온에서 보관
프로브 초음파 처리기	피셔 사이언티픽	Tel.: 100-132-894
프로테아제 억제제 칵테일(PIC) 정제	시그마 알드리치	5892791001	4°C에서 보관
RPMI 1640	써모피셔 사이언티픽	11875093	4°C에서 보관
나트륨 도데 실 황산염 (SDS)	써모피셔 사이언티픽	J18220입니다. 답1	2% SDS 솔루션 준비
SpeedVac 원심분리기	에펜도르프	07-748-15
STAGE 티핑 원심분리기	소네이션	STC-V2
T75 플라스크	써모피셔 사이언티픽	156499
트리플루오로아세트산	써모피셔 사이언티픽	85183
트리스 HCL pH 8.5	피셔 사이언티픽	BP152-1	4°C에서 보관
트립신/LysC	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A40009	부분 표본 및 -20°C에서 보관
초음파 수조	폭스바겐	97043-960
요소	바이오샵	URE001.1

호 ) . . 호 시리즈 년 시리즈 (영문) )