기능성 SARS-CoV-2 중화항체 평가

초록

이 비디오는 SARS-CoV-2 바이러스를 중화하는 혈청 효능을 측정하는 중화 분석을 보여줍니다. 여기에는 pseudotyped 바이러스, 혈청 희석 및 발광 기반 정량화가 포함되어 중화 역가를 밝힙니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 의사형 기반 중화 분석

참고: pMN은 SARS-CoV-2 스파이크에 대항하는 항체를 포함하는 인간 회복기 혈청 샘플을 통한 유사형 바이러스(PV) 매개 형질도입 억제입니다.

1. 멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 흰색 플레이트에 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) 50μl, 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Pen/Streptomycin)을 B-H행, 1-12열에 추가합니다.
2. 총 부피 100μl DMEM/10% FBS/1% P/S의 A 행, 열 2-10의 웰에 5μl 회복기 혈청을 추가합니다. 알려진 양(예: 5μl)의 양성(NIBSC 20/162 calibrant, HICC-pool 2 또는 HICC pool 3) 및 음성 항혈청(2019년 이전에 채취한 환자 혈청)을 대조군으로 well A11 및 A12에 추가합니다.
3. A 열 웰에서 50μl를 제거하고 그 아래의 모든 웰을 따라 2배 연속 희석을 수행합니다.
4. 각 희석 단계마다 멀티채널 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하고 기포가 생성되지 않도록 주의하여 5-10회 혼합합니다.
5. 연속 희석을 완료한 후 각 컬럼의 최종 웰에서 최종 50μl를 폐기해야 합니다.
   참고: 이 시점에서 각 웰에는 50μl의 혼합 DMEM과 환자 혈청 또는 대조군 혈청의 연속 희석액이 포함되어야 합니다.
6. 우물 벽에 액체가 남지 않도록 500rpm에서 1분 동안 원심분리기 플레이트를 사용합니다.
7. 유사형 적정을 통해 얻은 데이터를 사용하여 SARS-CoV-2 PV를 희석하여 50μl에서 5 x 10⁶ RLU를 얻는 데 필요한 DMEM의 양을 계산하고 총 부피는 5ml입니다.
8. 멀티채널 피펫을 사용하여 이 희석된 PV 용액을 피펫 수조에 혼합하고 웰 A6-A12(세포 전용 대조군)를 제외한 플레이트의 각 웰에 50μl를 분취합니다. A1-A6은 PV 전용 제어 역할을 합니다.
9. 우물 벽에 바이러스가 남지 않도록 500rpm에서 1분 동안 원심분리기 플레이트를 사용합니다.
10. 37°C 5% 이산화탄소(CO₂)에서 1시간 동안 플레이트를 배양하여 혈청이 SARS-CoV-2 당단백질에 결합할 수 있는 시간을 허용합니다.
11. 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2) 발현 플라스미드 및 막관통 세린 프로테아제 2(TMPRSS2) 발현 플라스미드로 24시간 전에 형질 주입된 HEK 293T/17 표적 세포 플레이트를 준비합니다.
    1. 플레이트에서 배양 배지를 제거합니다.
    2. 접시의 한쪽 면에 PBS 2ml로 플레이트를 두 번 세척하여 세포가 분리되지 않도록 하고 버리십시오.
    3. 플레이트에 트립신 2ml를 넣고 세포가 분리될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.
    4. 세포가 분리된 후 6ml의 DMEM/10% FBS/1% 페니실린/스트렙토마이신을 플레이트에 첨가하여 트립신 활성을 억제하고 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다.
    5. TC20^TM 자동 세포 계수기 또는 계수 챔버 슬라이드를 사용하여 세포를 계수하고 각 웰에 총 부피 50μl의 1 x 10⁴ 세포를 추가합니다.
12. 플레이트를 48-72 시간 동안 배양, 37 ° C, 5 % CO₂ .
13. 모든 웰에서 배양 배지를 제거하고 PBS: Bright Glo^TM luciferase 분석 시약의 1:1 혼합물 25μl를 첨가하여 GloMax® Navigator Microplate Luminometer에서 Bright Glo^TM luciferase 분석 시스템을 사용하여 플레이트를 판독합니다.
14. 광도계에서 제공하는 원시 데이터에서 확립된 프로토콜을 사용하여 절반 최대 억제 농도(IC50) 중화 항체 역가를 계산합니다. 1:40 희석 미만의 IC50 값은 음수로 간주됩니다. 또는 AutoPlate를 사용하여 데이터를 평가할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
MultiGuard 배리어 피펫 팁 1-20 μl	소렌슨 바이오사이언스	30550티
MultiGuard 배리어 피펫 팁 1-200 μl	소렌슨 바이오사이언스	30550티
NuncTM 세포 배양 접시 델타 표면 처리(10cm 멸균 접시)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	150350
피펫 대야(50ml)	일반적인
96웰 화이트 플레이트	써모 피셔사이언티픽(Thermo FisherScientific)	136101
HEK 293T/17 셀	증권 시세	CRL-11268
숙주 세포 진입 수용체 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2) 발현 플라스미드: pCDNA3.1+-ACE2			시몬스 2004
코로나바이러스 스파이크(S) 단백질 프라이밍 막관통 세린 프로테아제 2(TMPRSS2) 발현 플라스미드: pCAGGS-TMPRSS2			버트람 2010
포도당 4.5g/L를 함유한 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM), 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)	팬 바이오텍	P04-04510 P40-37500 P06-07100
FuGENE® HD 트랜스펙션 시약, 1ml	프로메가	E2311
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드	팬 바이오텍	P10-040100
SARS-CoV-2 PV를 중화할 수 있는 양성 대조 항체(Anti-SARS-CoV-2 Ab용 연구 시약)(NIBSC, 코드: 20/162, 국제적으로 사용 가능 또는 HICC-pool 2/HICC pool 3)
COVID-19 인간 회복기 혈장 검사
Bright Glo 루시퍼라아제 분석 시스템	프로메가	E2650