마우스 소변 포도당 농도의 정성적 및 정량적 평가를 위한 분석

초록

이 비디오는 쥐의 소변을 채취하여 포도당 수치를 평가하는 절차를 보여줍니다. 포도당 수치를 평가하려면 효소와 발색 염료로 코팅된 테스트 스트립을 샘플에 담그고 포도당 수치를 나타내는 색상 변화를 시작합니다. 소변 포도당 수치를 정량화하려면 포도당 농도가 상승하는 멀티웰 플레이트에 소변 샘플을 도입하고 반응 혼합물을 첨가한 다음 배양합니다. 흡광도를 측정하여 표준 곡선을 만들고 시료 흡광도를 기반으로 포도당 수치를 계산합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 스팟 소변 포도당 검사

1. 평평한 표면에 깨끗한 파라필름 조각을 놓습니다.
2. 쥐의 꼬리를 부드럽게 집어 파라필름에 올려
놓으세요.
3. 엄지와 검지를 사용하여 목덜미를 잡고 마우스를 고정합니다. 목덜미를 제지한 상태에서 마우스를 부드럽게 들어 올리면 마우스가 스트레스 반응으로 소변을 보게 됩니다. 소변 한 방울이 파라필름 표면에 떨어지도록 합니다. 소변 방울을 모은 후 마우스를 케이지로 되돌립니다.
4. Diastix 스트립의 시약 끝을 Parafilm 표면에 수집된 신선한 소변 방울에 담그십시오. 스트립을 즉시 제거하고 색상이 위로 향하게 하여 표면에 평평하게 놓으십시오. 스트립에서 색상이 완전히 나타날 때까지 최소 30초 동안 기다립니다. 현상된 색상을 Diastix 용기에 제공된 참조 차트와 비교합니다(그림 1).
   팁: 마우스가 파라필름에 소변을 않으면 검지를 사용하여 마우스의 하복부(방광 주변)에 부드러운 압력을 가합니다. 이 방법은 파라필름에 소변 방울을 방출하는 데 도움이 됩니다. 위에서 설명한 절차를 따른 후에도 소변을 않는 마우스의 경우 20분 동안 기다렸다가 절차를 다시 시작하십시오. IACUC 지침을 준수하는 동안 모든 절차가 수행되었는지 확인하십시오.

2. 마우스 대사 케이지를 사용하여 24시간 소변 수집

1. 제조업체의 지침에 따라 Tecniplast 대사 케이지(그림 2)를 조립합니다.
2. 공급 어셈블리를 분말 차우로 채운 다음 공급 어셈블리를 상부 챔버의 적절한 금속 탭에 부착합니다.
3. 상부 챔버의 나머지 금속 탭에 물병 지지대를 고정합니다.
4. 빈 물병을 채운 다음 병 지지대에 밀어 넣어 홀짝 튜브가 구멍에 있는지 확인합니다.
5. 신진대사 케이지에 쥐를 넣고 뚜껑으로 덮습니다.
6. 케이지 뚜껑이 제대로 끼워졌는지 확인하십시오.
7. 소변 채취 튜브와 대변 채취 튜브를 하단 챔버 바닥의 적절한 위치에 배치합니다.
8. 24시간 후, 소변 채취 튜브를 회수하고 포도당 분석을 수행하여 소변 포도당 농도를 확인합니다. 포도당 분석을 같은 날에 수행하지 않는 경우 소변 샘플을 -80°C 냉동고에서 동결합니다.

3. 24시간 소변 포도당 농도 측정

1. 소변 샘플이 -80°C에서 보관된 경우 포도당 분석을 수행하기 전에 샘플을 해동하십시오.
2. 100mg/dl 스톡에서 분석 키트 지침에 따라 25mg/dl에서 0mg/dl에 이르는 8가지 표준물질을 준비합니다.
3. 키트 설명서에 따라 96웰 플레이트에 표준 웰과 소변 샘플 웰을 모두 중복으로 준비합니다.
4. 모든 웰에 권장량의 효소 혼합물을 첨가하여 반응을 시작한 후 플레이트를 덮고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
5. 플레이트 리더를 사용하여 500-520 nm에서 흡광도를 판독합니다.
6. 분석 키트 지침에 따라 데이터를 분석합니다. 각 표준물질 대 포도당 농도의 흡광도를 플롯하고 그래프를 사용하여 24시간 소변 샘플의 포도당 농도를 결정합니다.

결과

그림 1. 현물 소변 포도당 검사. Parafilm에 수집된 쥐의 소변 방울과 Diastix 용기에 제공된 색상 참조 차트.

그림 2. 24시간 마우스 소변 채취를 위한 Tecniplast 대사 케이지. 쥐는 24시간 소변을 수집하기 위해 이 케이지에 단독으로 수용됩니다.