마우스 혈청에서 테스트 백신에 대한 면역글로불린 G 수치 측정

초록

출처: Zeng, X. et al., 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 감염에 대한 나노에멀젼 보조 백신의 면역 반응 평가.J. Vis. 특급(2023년)

이 비디오는 사전 면역 마우스에서 새로운 나노 에멀젼 보조 백신에 대한 항체 면역 반응을 평가하는 방법을 보여줍니다. 면역은 IgG 항체 역가를 측정하여 확인된 항체 반응을 향상시킵니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. MRSA HI 항원 단백질의 제조

1. 상용 소스에서 Fe 이온 표면 결정 인자 B(IsdB) 및 α-용혈 돌연변이(Hla) 클론을 얻고(재료 표 참조), 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 수행하여 IsdB 및 Hla 유전자를 증폭하고, 해당 산물을 PGEX-6P-2 플라스미드(상업적으로 획득, 재료 표 참조)에 접합합니다. Escherichia coli의 벡터 Xl/blue 균주가 있는 화면.
2. positive clone을 E. coli BL21 competent cells(재료 표 참조)로 형질전환하고 shark culture로 증폭합니다.
3. isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside 및 MMC(Multimodal Chromatography) 분리 키트로 유도 후 항원을 발현하고 분리합니다(재료 표 참조).
4. 항원 단백질의 특성을 분석하고 완전 자동화 정제기로 정제합니다.
   1. 상업적으로 이용 가능한 친화성 크로마토그래피 수지를 사용하여 투명화된 용해물에서 GST(gutathione S-transferase) 태그가 지정된 단백질을 Affinity-purify 합니다(재료 표 참조).
   2. 이소프로필-β-D-1-메르캅토갈락피라노시드 및 멀티모달 크로마토그래피(MMC)로 재조합 단백질을 정제합니다.
   3. Triton X-114 상분리법으로 내독소를 제거합니다. 간단히 말해서, 1% Triton X-114와 재조합 단백질 용출액을 0°C에서 5분 동안 혼합하여 균일한 용액을 만들고 37°C에서 5분 동안 배양하여 2상이 형성될 수 있도록 합니다.
5. Turtle 키트(재료 표 참조)와 함께 박테리아 내독소 테스트 방법을 사용하여 내독소 농도를 검출합니다. 단백질 항원에 대한 내독소는 0.06 EU/μg으로 국제 표준(1.5 EU/μg)보다 낮습니다.
   1. 내독소 검출에 대한 테스트 제품의 가능한 영향을 제거하기 위해 간섭 테스트를 수행합니다.
      메모: 중국 약전의 부록 2020에 따르면 내독소 함량은 5EU/용량 미만이어야 합니다. Limulus lysate(λ0.25 EU/mL)의 감도와 최대 유효 희석 비율 33.3은 최대 유효 희석인 MVD = cL/λ를 기준으로 계산되었으며, 여기서 L은 시험 품목에 대한 세균 내독소의 한계값, c는 시험 품목 용액의 농도, L이 EU/m로 표시되는 경우, c는 1.0mg/mL와 같습니다. λ는 겔 방법에서 투구게 시약의 표지된 감도(EU/mL)입니다.
6. 항원(48kDa, 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel 전기영동[SDS-PAGE]에 의해 결정됨)을 내독소 또는 인산염 완충 식염수(PBS)(sodium dichlorate 방법)가 없는 멸균수에서 1.5mg/mL로 재조합합니다.
   참고: 단백질 피크 시간은 13.843분, 순도는 99.4%(고성능 액체 크로마토그래피 방법)였으며 단백질은 -70°C에서 보관했습니다. S. aureus 균주 MRSA252(재료 표 참조)에서 추출한 게놈 DNA를 PCR 템플릿으로 사용했습니다. IsdB 유전자는 전방 프라이머 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
   를 사용하여 증폭되었습니다. C-39 및 리버스 프라이머 59-TTTTCCTTTTGCGG
   CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39.
   Hla 유전자는 정방향 프라이머 PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) 및 역방향 프라이머 PHLAR (TAAGCGGCCGCTTATCAATTTGTCATTTCTTC)를 사용하여 증폭되었다.

2. 나노 에멀젼 백신의 준비

1. 1:6:3(w/w)의 질량비에 따라 HI 항원 단백질 용액(10mg/mL)에 3종류의 부형제(이소프로필 미리스테이트, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 프로필렌 글리콜, 재료 표 참조)를 차례로 첨가하고 잘 저어줍니다. 그런 다음 점차적으로 멸균된 순수를 추가하여 최종 부피 10mL에 도달하고 500rpm 및 25°C에서 약 20분 동안 저어줍니다.
   메모: 이 프로토콜에서 제조된 나노에멀젼은 부피가 10mL이고 3가지 부형제의 질량은 각각 0.34g, 2g, 1g입니다. 여기서 단백질 용액은 최종 용액 농도의 10배인 작동 용액입니다.
2. 투명하고 투명한 액체 용액을 얻기 위해 저에너지 유화법으로 나노에멀젼 보조 백신(1mg/mL 단백질)을 준비합니다.
   메모: 블랭크 나노에멀젼(BNE)은 물을 HI로 대체한 것을 제외하고는 유사한 방법으로 제조했습니다. 일반적인 유화 방법은 유화를 위해 외부 및 내부 상을 약 80°C로 가열한 다음 점차적으로 교반 및 냉각하는 것입니다. 이 과정에서 많은 양의 에너지가 소비되고 최종적으로 에멀젼이 얻어집니다.

3. 나노에멀젼 보조제 백신의 물리적 특성 및 안정성

1. 입자 크기, 제타 전위 및 고분자 분산 지수 특성화(PDI).
   1. 나노에멀젼 보조제 백신 100μL를 준비하고 주사용 물로 50배 희석합니다. 검출을 위해 샘플 2mL를 추가합니다.
   2. Nano Zetasizer(ZS, 재료 표 참조)를 사용하여 25°C에서 입자 크기, 제타 전위 및 PDI를 관찰합니다.
2. 투과 전자 현미경 (TEM)
   1. 나노에멀젼 백신 10μL를 물로 50배 희석하고 탄소로 코팅된 100메쉬 구리 그리드에 놓고 실온에서 5분 동안 1% 포스포텅스텐산(재료 표 참조)으로 염색합니다.
   2. 여과지로 과도한 포스 포 텅스텐 산 용액을 제거하십시오.
   3. 투과 전자 현미경으로 형태를 관찰합니다(재료 표 참조). 완제품이 전자 현미경의 시야 내에서 거의 안정적이고 원형인지, 그리고 양호한 분산을 나타내는지 여부를 검사합니다.
3. 주사 전자 현미경(SEM)
   1. 나노에멀젼 보조제 백신 10μL를 물로 50배 희석하고, 미리 희석된 샘플 10μL를 실리콘 웨이퍼에 떨어뜨린 다음 37°C 온도 조절기 제어 인큐베이터에 24시간 동안 넣습니다.
   2. 준비된 백금을 실리콘에 40초 동안 뿌리고 실온으로 식힙니다.
   3. 준비된 샘플의 형태학적 특성을 고해상도 주사 전자 현미경으로 관찰합니다(재료 표 참조). 샘플이 거의 안정적이고, 구형이며, 전자 현미경의 시야 내에 잘 분산되어 있는지 확인합니다.
4. 형태학적 안정성
   1. 마이크로 원심분리 튜브에 나노 에멀젼 백신 샘플 1mL를 놓고 실온(25°C)에서 13,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 신선한 샘플의 안정성을 평가합니다.
   2. 이러한 신선한 샘플의 모양을 관찰한 다음 6가지 온도 주기의 열역학적 안정성 테스트를 수행합니다(1주기: 48시간 동안 4°C, 48시간 동안 25°C, 48시간 동안 37°C에서 보관).
   3. 원심분리 후 샘플을 15분 동안 그대로 두어 Tyndall 효과(샘플이 빛 아래에서 투명하고 투명한지 여부)가 있는지와 항유화가 발생했는지 여부(항유화 후 명확한 층화로 나타남)를 확인합니다.
5. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯
   1. 샘플을 흔들어 0.6mL의 무수 에탄올 용액과 0.3mL의 백신을 혼합하고 원심분리기(13,000 x g, 실온에서 30분, 25°C)를 혼합합니다.
   2. 용액의 상등액을 깨끗한 튜브로 옮기고 침전물을 물 0.3mL로 용해시킵니다. 상층액과 침전액(블랭크 나노에멀젼 및 백신 모두)을 무수 에탄올과 증류수 용액으로 처리한 후 수득하고 동일한 50배 희석을 수행합니다.
   3. 2.5mL의 분리 겔 A와 2.5mL의 분리 겔 B(재료 표 참조)를 혼합하고 50μL의 10% 과황산암모늄을 첨가한 다음 피펫을 사용하여 용액을 유리판에 빠르게 놓습니다. 1mL의 농축 젤 A와 1mL의 농축 젤 B를 혼합하고 유리판에 20μL의 10% 과황산암모늄을 넣고 적절한 크기의 빗을 삽입하고 응고를 기다립니다.
   4. 3.5.2단계에서 얻은 희석된 샘플에 총 5μL의 5x 단백질 로딩 완충 용액을 추가하고 샘플을 5분 동안 끓입니다.
   5. 가열된 단백질 10μL를 해당 웰에 추가하고 단백질 마커 5μL를 마커 웰에 추가합니다.
   6. 전극을 연결하고 전기영동 측정기를 켜고(재료 표 참조) 볼륨을 조정합니다.tage를 300V로 조정합니다. 전기영동이 PAGE 고무 바닥에서 1cm 떨어진 곳에 도달하면 전원을 끕니다.
   7. 젤을 제거하고 이중 증류수(ddH₂O)로 헹굽니다. Coomassie 밝은 파란색 G-250 염색 용액(재료 표 참조)을 10분 동안 추가합니다. 염색 용액을 붓고 용액과 시중에서 판매되는 탈색 용액으로 젤을 두 번 헹구고 젤을 전자레인지에 1분 동안 돌립니다. 젤을 10분 동안 흔들고 젤 배경이 깨끗해질 때까지 탈색 용액을 반복적으로 변경합니다. 그런 다음 겔 이미징을 수행합니다(재료 표 참조).
      메모: 웨스턴 블롯은 3.5.1-3.5.6 단계에서 설명한 대로 전처리되었습니다.
   8. 3개의 여과지 블록을 전기영동 전달 버퍼로 담그십시오. 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인을 메탄올에 30초 동안 담그고 세미드라이 겔 전사 기기(여과지 2층, PVDF 멤브레인, 전기영동 젤 1층)로 전사합니다. 23V의 전압을 사용하여 23분 동안 멤브레인을 전송합니다.
   9. PVDF 멤브레인을 제거하고 이식 후 트리스 완충 식염수-Tween 20(TBST)으로 한 번 세척합니다.
   10. PVDF 멤브레인을 밀봉 용액(5% 탈지 분유 용액)에 넣고 4°C에서 밤새 밀봉합니다.
   11. PVDF 멤브레인을 제거하고 TBST로 3회 또는 각각 10분씩 세척합니다.
   12. 1차 항체(양성 혈청이 있는 면역된 마우스)로 배양합니다. TBST로 테스트할 1차 항체(Table of Materials(재료 표 참조)를 500배(100배)로 희석합니다. 차단된 PVDF 멤브레인을 1차 항체에 배치하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   13. PVDF 멤브레인을 제거하고 TBST로 각각 10분씩 3회 세척합니다.
   14. 2차 항체로 배양합니다(Table of Materials(재료표 참조). TBST로 묽은 알칼리성 인산가수분해효소(AP) 표지된 염소 항마우스 2차 항체 5,000배. PVDF 멤브레인을 2차 항체에 넣고 37°C에서 40분 동안 배양합니다.
   15. PVDF 멤브레인을 제거하고 TBST로 각각 10분씩 4회 세척합니다.
   16. 염색을 위해 PVDF 멤브레인을 AP 기질 니트로 블루 테트라졸(NBT) 및 BCIP(5-브로모-4-클로로-3'-인도리포스페이트 p-톨루이딘 염)의 혼합물(멤브레인을 적실 만큼만)에 담그십시오(재료 표 참조). 양성 결과는 보라색입니다.
       참고: 결과는 선명한 보라색 띠여야 하며 샘플 스트립과 항원의 분자량은 동일한 라벨링된 위치에 있어야 합니다.

4. 근육 투여 후 이 백신에 대한 항체 면역 반응 평가

참고: 생쥐는 발표된 보고서에 따라 나노에멀젼 백신의 근육 주사로 면역되었습니다. 마우스는 음성 대조군으로 PBS를 투여했습니다. 3회 면역 접종이 완료된 후 1주일 후에 마우스에서 혈청을 채취했습니다. IgG의 혈청 수준과 IgG1, IgG2a 및 IgG2b의 하위 분류는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 정량적으로 측정되었습니다.

1. 항원 코팅: 코팅 용액으로 HI 단백질 항원을 10μg/mL로 희석하고 100μL/웰에서 ELISA 플레이트에 추가합니다. 4 °C에서 밤새 배양합니다.
   메모: 코팅 용액은 1.6g의 무수 탄산나트륨과 2.9g의 중탄산나트륨을 1L의 탈이온수에 용해시켜 제조합니다.
2. 씰링: 플레이트를 세척합니다(3회 사이클, 각 사이클 300μL). 밀봉 용액 300μL를 각 웰에 추가하고 37°C에서 2시간 동안 웰을 밀봉합니다.
   메모: 밀봉 용액은 PBS에 Tween-20 및 소 혈청 알부민(BSA)을 첨가하여 준비됩니다. PBST 용액의 BSA 함량은 1%입니다.
3. 혈청 희석: 생쥐의 시료 혈청을 PBST로 100회 희석하고(혈청 3μL를 PBST 및 볼텍스 297μL에 첨가), 각 혈청 시료에 100μL를 사용합니다. PBST에 4 μL를 첨가하여 양성 혈청과 음성 대조 혈청을 PBST로 100회 희석한 후 볼텍싱으로 혼합합니다.
4. 이중 비율 희석: 코팅된 ELISA 플레이트의 첫 번째 열에 위의 희석된 실험용 혈청 200μL를 추가하고 첫 번째 및 12^번째 열을 제외한 모든 웰에 PBST 100μL를 추가합니다. 첫 번째 줄에서 연속적으로 1:2 희석을 수행합니다: 피펫을 100 μL로 조정하고, 첫 번째 행에서 두 번째 줄로 100 μL를 옮기고, 피펫과 10회 혼합합니다.
5. 혈청을 여러 비율로 Row 11로 희석하고 액체 100μL를 버립니다.
6. 샘플 템플릿(표 1 참조)-100 μL/well에 따라 12행의 해당 well에 희석된 음성 및 양성 혈청을 추가합니다.
7. ELISA 플레이트를 비닐 랩으로 밀봉하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
8. 2차 항체 항-마우스 IgG-HRP(재료 표 참조)를 PBST로 1:10,000으로 희석합니다.
9. 플레이트를 세척합니다(3회 주기, 각 주기 300μL). 그런 다음 각 웰에 희석된 2차 항체 100μL를 추가하고 플레이트를 37°C에서 40분 동안 배양합니다.
10. 염색 및 종결: 플레이트를 세척합니다(5회 주기, 각 주기 300μL). 각 웰에 3,3",5,5"-테트라메틸벤지딘(TMB) 염색 용액(100μL, 재료표 참조)을 추가합니다. 플레이트를 빛에서 10 분 동안 37 °C에 놓고 2 M H₂SO₄ 의 50 μL로 즉시 반응을 종료하십시오.
11. 효소 마커로 광학 밀도(OD₄₅₀) 값을 검출합니다(종료 후 15분 이내에 OD₄₅₀ 값 판독).

표 1: ELISA 스파이크 서열 및 희석 템플릿.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5424- 소형 고속 원심 분리기FA-45-24-11	Eppendorf, 독일	5424000495
96웰 플레이트	Corning Incorporated, 미국	CLS3922
AFM 디멘션 패스트스캔	BRUKER, 독일	영
Balb/c 마우스	베이징 HFK Bioscience Co., 주식 회사.
비씨피/NBT	복주 Maixin 생명 공학 개발 회사, 중국	비씨피/NBT
Bio-Rad 6.0 마이크로플레이트 리더	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., 캘리포니아, 미국	영
BL21 컴피턴트 셀	머크 밀리포어, 독일	70232-3CN
BSA-100지	Sigma-Aldrich, 미국	나2064-100지
원심분리기 5810 R	Eppendorf, 독일	5811000398
Coomassie 밝은 파란색 G-250 염색 용액	MIKX, 중국	DB236
탈색 용액	보스터, 중국	아칸소0163-2
전기 가열 서있는 온도 경운기 HH-B11-420	상하이 Yuejin 의료 기기 공장, 중국	영
전기영동 장치	베이징 Liuyi 악기 공장, 중국	DYCZ-25D
젤 이미지	Tanon, 미국	영
글루타티온-세파로스 수지 GST	Mei5bio, 중국	친화성 크로마토그래피 수지
H2이렇게4	청두 KESHI 화학 유한 공사, 중국	Tel.: 7664-93-9
HI 재조합 단백질	제 3 군 의과 대학, 중국	110-27-0
HRP - 염소 안티 마우스 IgG	Biodragon, 중국	BF03001
HRP- 염소 안티 마우스 IgG1	Biodragon, 중국	BF03002R
HRP- 염소 안티 마우스 IgG2a	Biodragon, 중국	BF03003R
HRP- 염소 안티 마우스 IgG2b	Biodragon, 중국	BF03004R
접종 루프	Haimen Feiyue Co., LTD, 중국	YR-JZH-1UL
IsdB 및 Hla 클론	상하이 Jereh 생명 공학 공동, 중국	영
이소 프로필 육두구 (제약 보조제)	SEPPIC, 프랑스	영
이소프로필-β-D-1-메르캅토갈락토피라노사이드	fdbio, 중국	FD3278-1
LB 부용 배양 매체	베이징 AOBOX 생명 공학 유한 공사, 중국	02-136
저온 냉장 원심분리기	Eppendorf, 독일	영
맬번 나노 ZS	Malvern Instruments Ltd., 영국	영
마이크로 플레이트 세탁기 405 LSRS	Bio Tek Instruments, Inc 하이랜드 파크, 미국	영
Mini-TBC 컴팩트 필름 전사 기기	BeiJingDongFangRuiLi Co., LTD, 중국	1658030
MMC 패킹	TOSOH (SHANGHAI) CO., LTD	22818
MRSA252	미국, ATCC	영
Nanodrop 자외선 분광 광도계	Thermo Scientific, 미국	영
New FlashTM Protein any KD PAGE 단백질 전기영동 젤 키트	DAKEWE, 중국	8012011
PBS (PBS)	biosharp, 중국	영
PCR, 증폭기	Thermal Cycler, 미국	영
pGEX 표적 유전자 재조합 플라스미드	상하이 Jereh 생명 공학 공동, 중국	나3528G
포스 포 텅스텐 산	G-CLONE, 중국	CS1231-25g
피펫	Eppendorf, 독일	3120000844
Polyoxyethylated 피마자유 (pharmaceutic adjuvant)	알라딘, 중국	K400327-1kg
1차 항체	실험실에서 만든 : 양성 혈청을 가진 면역 된 마우스에서	영	자세한 내용은 참조 11을 참조하십시오
프로필렌 글리콜 (제약 보조제)	Sigma-Aldrich, 미국	P4347-500ML
단백질 마커	Thermo Scientufuc, 미국	26616
PVDF 전사 멤브레인	Invitrogen, 미국	88518
주사 전자 현미경	JEOL, 일본	JSM-IT800
탈로스 L120C TEM	써모 피셔, 미국	영
TMB 컬러 솔루션	TIAN GEN, 중국	PA107-01 (폴리아미드
거북이 키트	Xiamen Bioendo 기술 Co., 주식 회사	ES80545
트윈-20	Macklin, 중국	9005-64-5

시리즈 . 시리즈 ) 년