1. 인플루엔자 A 바이러스, 카스파제에 의한 IAV 감염 세포에서 단백질의 분열 또는 분해 평가
- 12웰 세포 배양 플레이트의 웰당 3 x 105 Madin-Darby Canine Kidney(MDCK) 또는 A549 세포를 시드합니다.
메모: MDCK 세포를 사용하는 경우 관심 단백질에 대한 항체가 개 종을 인식하는지 확인하십시오.
- 웰을 쌍으로, 즉 uninfected-mock 샘플에 대한 control pair-one well과 infected-mock 샘플에 대한 well, uninfected-inhibitor A 샘플에 대한 테스트 pair-one well과 infected-inhibitor A 샘플에 대한 1개의 well을 파종합니다. 각 추가 억제제의 쌍 수를 늘립니다.
- 37°C에서 5% CO2 대기에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.
- 다음 날, 세포를 IAV(H1N1 아형 또는 다른 아형)로 감염시킵니다.
- 이를 위해 0.5-3.0 플라크 형성 단위(pfu)/세포(MOI 계산 시 세포 수의 두 배 계수)의 감염 다중성(MOI)에서 400μL의 혈청이 없는 최소 필수 배지(MEM)(재료 표 참조)에 바이러스 스톡을 희석하여 바이러스 접종물을 준비합니다.
메모: MDCK 세포를 감염시키기 위해 최종 농도 1μg/mL의 토실 페닐알라닐 클로로메틸 케톤(TPCK)-트립신을 바이러스 접종물에 보충합니다.
- 세포에서 오래된 배양 배지를 제거하고(단계 1.3) 1mL/웰의 무혈청 MEM 2x로 세포를 세척합니다.
- 세포에 400μL의 바이러스 접종물(단계 1.4.1)을 추가하고 5% 이산화탄소(CO2) 분위기에서 35°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 그 동안, 카스파제 억제제(예: Z-DEVD-FMK), 리소좀 억제제(예: 염화암모늄, NH4Cl) 또는 프로테아좀 억제제(예: MG132)(재료 표 참조)를 각각 40μM, 20mM 또는 10μM의 최종 농도로 혈청이 없는 MEM으로 희석합니다(재료 표 참조).). 후자의 두 억제제는 대조군 역할을 합니다. 억제제 중 하나를 혈청이 없는 배지에서 모의(mock)로 재구성하는 데 사용되는 동일한 부피의 용매(물 이외의 경우)를 희석합니다.
- 바이러스 접종물을 제거하고 1.5(1x)단계와 같이 세포를 세척합니다.
- 억제제로 모의하거나 보충된 무혈청 MEM(1mL/well)을 세포에 추가하고 1.6단계와 같이 세포를 배양합니다. 이 시점은 0시간 감염으로 간주됩니다.
- 24시간 후 1mL 주사기 플런저(고무 면)로 세포를 긁어내어 세포를 채취하고 1.5mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
- 실온에서 1-2분 동안 12,000 x g에서 튜브를 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 수집합니다.
메모: 이 상등액은 폐기되거나 방출된 바이러스 자손의 역가를 측정하기 위한 플라크 분석에 사용될 수 있습니다.
- 1.11단계와 같이 재원심분리를 통해 250μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포 펠릿을 세척합니다.
- 상층액을 제거하고 세포 용해 완충액 80-100 μL(50 mM Tris(hydroxymethyl) aminomethane (THAM) hydrochloride (Tris-HCl), pH 7.4, 150 mM sodium chloride (NaCl), 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.5% sodium deoxycholate, 1% Triton X-100 및 1x protease inhibitor cocktail, Table of Materials) 및 vortexing을 첨가하여 세포를 용해합니다.
- 튜브를 98°C에서 10분 동안 가열하여 완전히 용해하고 전체 세포 용해물을 준비합니다. 다음날 1.15-1.17 단계를 수행하기 위해 용해물을 4 °C에서 보관하되, 최상의 결과를 얻으려면 같은 날에 이 단계를 완료하십시오.
- bicinchoninic acid (BCA) tableassay kit를 사용하여 각 샘플의 단백질 양을 추정합니다(재료 표 참조).
- 분자량 마커와 함께 표준 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 감염되지 않은 샘플과 감염된 샘플에서 동일한 양의 단백질을 분리합니다.
- 단백질을 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 전달합니다(재료 표 참조).
메모: PVDF 멤브레인은 일부 웨스턴 블롯 이미저에서 높은 배경을 제공할 수 있습니다. 호환성을 확인합니다.
- 웨스턴 블로팅(western blotting)을 수행하여 다른 곳에 설명된 방법을 사용하여 관심 단백질을 검출합니다.
- 모의 처리된 샘플과 억제제 처리된 감염된 샘플 레인의 단백질 수준을 비교합니다.
메모: 카스파제 억제제로 처리된 감염된 샘플 레인에서 단백질 수치가 회복되면 단백질이 카스파제에 의해 절단되거나 분해됩니다. 그렇지 않으면 리소좀 또는 프로테아좀에 의해 분해됩니다.
- 동일한 실험의 최소 3회 반복에서 각 레인의 밴드 강도를 측정하고 해당 로딩 제어 밴드로 정규화하여 단백질 회수율을 정량화합니다.
- 최신 이미저 및 관련 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 웨스턴 블롯을 이미징하고 단백질 회수율을 정량화합니다.
