박테리아 세포에서 형광 항생제 프로브의 축적을 측정하기 위한 분석

초록

출처: Stone, M. R. L., et al. 형광 항생제 프로브를 사용한 세균 내성 시각화. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 박테리아 세포에서 형광 항생제 프로브의 축적을 측정하는 분석을 보여줍니다. 유출 펌프 억제제에 노출되면 박테리아 세포의 막관통 양성자 구배가 방해를 받아 형광단 접합 항생제가 추가됩니다. 파괴된 양성자 구배로 인한 유출 펌프의 억제는 박테리아 내부에 항생제의 축적을 유발합니다. 박테리아 세포를 용해시키고 형광 강도를 측정하여 항생제 축적을 확인합니다.

프로토콜

1. 항균 활성 평가

참고: 박테리아와 관련된 모든 작업은 분석 또는 실험실의 오염을 방지하기 위해 멸균 상태에서 수행해야 합니다. 모든 매체는 사용 전에 고압멸균해야 하며 플라스틱 제품 및 피펫과 같은 장비는 멸균 상태로 유지해야 합니다. 작업은 생물 봉쇄 후드(유형 2)에서 수행하는 것이 좋습니다.

1. 항생제 골격에 적합한 박테리아 균주의 글리세롤 스톡을 lysogeny broth 한천 (LB, 제조업체의 지침에 따라 준비)에 줄무늬를 만들고 37 ° C에서 밤새 자랍니다 .
   메모: 항균 활성을 테스트하기 위한 박테리아의 선택은 사용되는 항생제 스캐폴드를 기반으로 이루어져야 합니다. 항생제에 취약한 것으로 알려진 종 중에서 5-10개의 대표 박테리아를 선택해야 하며, 실험실의 물류 능력을 고려해야 합니다. 가능하면 내성 박테리아도 테스트해야 합니다. 아래에 제공된 프로토콜은 대부분의 박테리아에 적용되지만 특별한 조건(예: CO₂, 특수 매체)이 필요한지 확인하고 필요에 따라 변경합니다. 이러한 조건을 사용하여 성공적으로 분석된 박테리아에는 포도상구균, 연쇄상구균, 간균, 대장균, 폐렴간균, 녹농균 및 엔테로코커스 패시움이 포함됩니다.
2. 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 37°C에서 양이온 조정 Mueller-Hinton Broth(CAMHB, 제조업체의 지침에 따라 준비) 5mL에서 하룻밤 동안 배양합니다.
3. CAMHB에서 하룻밤 배양을 ~40배로 희석하고 600nm(OD₆₀₀) = 0.4–0.8, 부피 5mL)에서 광학 밀도인 중간 로그 상으로 성장합니다.
4. 멸균수에 1.28mg/mL의 속도로 각 형광 항생제의 원액을 준비하고 96웰 플레이트의 첫 번째 컬럼에 10μL의 항생제를 피펫팅합니다.
5. 첫 번째 컬럼에 90μL의 CAMHB를 추가하고 다른 모든 웰에 50μL를 추가합니다. 그런 다음 플레이트 전체에 걸쳐 연속 2배 희석을 수행합니다.
6. 중간 대수 상 배양을 철저히 혼합한 다음 ~10⁶ 집락 형성 단위(CFU)/mL로 희석하고 모든 웰에 50μL를 추가하여 ~5 x 10⁵ CFU/mL.
   의 최종 농도를 제공합니다. 배양 부피 (mL) = (매체 부피 (mL) / (OD₆₀₀ x 1,000)
   예를 들어, 12mL의 원하는 배지 부피에서 OD₆₀₀ = 0.5 배양의 경우 12mL의 배지에 (12/(0.5 x 1,000) = 0.024mL의 배양액을 추가합니다
.
7. 접시를 뚜껑으로 덮고 흔들지 않고 37 ° C에서 18-24 시간 동안 배양합니다.
8. MIC가 눈에 띄는 성장이 없는 가장 낮은 농도 웰인 상태에서 플레이트를 육안으로 검사합니다.
   메모: 활성 및 비활성 형광 항생제의 몇 가지 예는 표 1을 참조하십시오.

2. 분광광도계에 의한 프로브 축적 분석

참고: 이러한 원심분리 시간은 E. coli에 최적화되어 있으므로 다른 종의 경우 약간의 변경이 필요할 수 있습니다. 프로브 축적에 대한 대표적인 데이터는 NBD 표지된 시프로플록사신 프로브에 대해 보고됩니다.

1. 박테리아 균주의 글리세롤 줄기를 LB 한천에 줄무늬 넣고 37 ° C에서 밤새 자랍니다.
2. 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 37 ° C의 LB에서 하룻밤 동안 배양합니다.
3. 하룻밤 사이에 배양물을 배지에서 ~50배 희석하고 중간 로그 단계(OD₆₀₀ = 0.4–0.8)까지 성장합니다.
4. 1,470 x g에서 25분 동안 배양물을 원심분리하고 배지를 디캔팅합니다.
5. 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 박테리아를 재현탁시킨 다음 1,470 x g에서 15분 동안 원심분리합니다.
6. 배지를 디캔팅하고 세척된 펠릿을 PBS에서 최종 OD₆₀₀ = 2로 재현탁합니다.
7. 원하는 경우 10.1 μL의 카르보닐 시안화물 3-클로로페닐히드라존(CCCP, PBS에서 10 mM)을 1 mL의 박테리아(최종 농도 100 μM)에 첨가하고 37 °C에서 10분 동안 배양합니다.
   메모: CCCP는 유출 펌프 억제제입니다. CCCP를 추가하면 유출의 영향을 조사할 수 있습니다.
8. 18,000 x g에서 20°C에서 4분 동안 배양물을 원심분리하고 배지를 디캔팅합니다.
9. 펠릿에 형광 항생제 용액 1mL(PBS에서 10–100μM)를 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
10. 18,000 x g에서 4°C에서 7분 동안 배양물을 원심분리하고 배지를 디캔팅합니다.
11. 1mL의 차가운 PBS에 박테리아를 재현탁시키고 2.9단계를 반복합니다.
12. 2.10단계를 총 4번 반복합니다.
13. 원하는 경우 180 μL의 용해 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 및 2 mM sodium EDTA)을 첨가 한 다음 70 μL의 라이소자임 (H₂O에서 72 mg / mL)을 첨가하여 박테리아를 용해시킵니다.
14. 37°C에서 30분 동안 배양한 다음 3회(-78°C에서 5분, 34°C에서 15분)
로 동결-해동합니다.
15. 샘플을 20분 동안 초음파 처리한 다음 65°C에서 30분 동안 가열합니다.
16. 용해된 샘플(18,000 x g, 8분)을 원심분리한 다음 10kDa 필터 멤브레인을 통해 여과합니다.
17. 100μL의 물로 필터를 4x 세척합니다.
18. 용해물을 바닥이 평평한 검은색 96웰 플레이트로 옮기고 형광단에 적합한 여기 및 방출 파장으로 플레이트 리더에서 형광 강도를 측정합니다(즉, 7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl [DMACA]: λ_ex = 400 nm, λ_em = 490 nm; 니트로벤즈옥사디아졸 [NBD]: λ_ex = 475 nm, λ_em = 545 nm).
    메모: 형광 NBD 표지된 시프로플록사신 항생제를 사용한 박테리아의 분광광도계 분석의 예는 그림 1을 참조하십시오.

결과

표 1. 배지 미세희석 MIC 분석으로 측정한 적절한 임상적으로 관련된 박테리아 균주에 대해 시프로플록사신, 트리메토프림 및 리네졸리드를 기반으로 하는 형광 항생제 프로브의 항생제 활성. 대부분의 경우, 프로브는 모체에 비해 일부 활성을 잃었지만 측정 가능한 항생제 효능(추가 연구에 유용하기에 충분)은 유지했습니다.

		마이크 (μg/mL)
종	거르다	시프로	시프로-NBD

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Amicon Ultra-0.5 원심 필터 장치(Ultracel-10 멤브레인 포함	머 크	UFC501096
Bruker Avance 600MHz 분광계	브루커
CCCP (영문)	시그마-알드리치	C2759
셀라이트 545	시그마-알드리치	22140-5KG-F
사이겔	아캄	AB109204
FM4-64FX, FM™ 4-64 멤브레인 스테인의 고정 가능한 아날로그	라이프 테크놀로지스 오스트레일리아 Pt	F34653
감마 2-16 LSCplus 동결 건조	그리스도
Hettich Zentrifugen 로토픽스 32	헤티치
파운드	암레스코	J106
닭고기 달걀 흰자 에서 추출한 라이소자임 동결건조 분말	시그마-알드리치	L6876
Mueller Hinton II Broth Cation 조정	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	212322
Sigma 1-15 마이크로 원심분리기	시그마-알드리치
테칸 인피니트 M1000 프로	테칸

) (영어)