질량 세포 분석 이미징을 위한 조직 면역염색

초록

이 비디오는 질량 세포 분석 이미징을 위한 조직 샘플 준비에 대해 설명합니다. 조직은 먼저 항원 항원결정기의 가면을 벗기고, 세포를 투과화하며, 비특이적 항체 결합 부위를 차단하기 위해 처리됩니다. 그런 다음 조직을 금속 접합 항체 칵테일과 핵 염색으로 배양합니다. 마지막으로, 처리된 조직 샘플은 광학 스캐너를 사용하여 이미지화됩니다.

프로토콜

1. 조직 전처리:

신선 냉동 조직의 경우:

1. 사용하기 전에 -20°C 냉동고에 유리 Coplin 용기를 최소 1시간 동안 두십시오.
2. -80°C 냉동고에서 슬라이드를 제거하고 -20°C 냉동고의 유리 코플린 병에 최소 15분 동안 넣습니다.
3. 흄 후드 아래에서 앰플 커터를 사용하여 16% 파라포름알데히드(PFA) 유리 앰플을 엽니다. 깨진 유리는 적절하게 버리십시오.
4. 16% PFA 10mL와 30mL 인산염 완충 식염수(PBS)를 플라스틱 Coplin 용기에 추가합니다. PBS가 4°C로 예냉각되었는지 확인합니다.
5. 이 용액을 4°C 냉장고에 최소 15분 동안 옮기십시오.
6. 15분 후 슬라이드가 있는 유리 코플린 용기를 4°C 냉장고에 10분 동안 옮깁니다.
7. 유리병의 슬라이드를 차가운 4% PFA 용액이 들어 있는 플라스틱 Coplin 용기로 옮깁니다.
8. 4% PFA가 함유된 슬라이드를 냉장고 안에서 30분 동안 고정하세요.
9. 슬라이드를 실온 PBS에서 각각 5분 동안 세 번 헹구어 주기 사이에 철저히 헹굽니다.

FFPE 조직의 경우:

1. 양전하를 띤 표준 현미경 슬라이드에 장착된 5μm 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 절편부터 시작합니다.
2. 슬라이드를 60°C에서 1시간 동안 가열하여 왁스를 제거합니다.
3. 슬라이드를 제거하고 약 5분 동안 실온으로 식힙니다.
4. 슬라이드를 슬라이드 메일러에 넣고 자일렌 욕조에서 3분 동안 두 번씩 헹굽니다.
5. 다시 말하지만, 100% 에탄올로 슬라이드를 1분, 두 번 헹굽니다.
6. 마찬가지로 슬라이드를 95% 및 70% 에탄올로 각각 1분씩 헹굽니다.
7. 마지막으로 증류수에 3분 동안 두 번 마지막으로 헹굽니다.
   메모: 하이페리온은 슬라이드 가장자리, 중앙 조직에서 가능한 한 많이 제거될 수 없습니다.

2. 열 유도 에피토프 회수(HIER)

1. 트리스-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) pH9 완충액을 준비합니다.
   1. Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER 버퍼는 100배로 구입하여 1배로 희석하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 물에 넣습니다.
   2. 예: 2.5mL Abcam ab93684를 247.5mL HPLC 물에 넣습니다.
      메모: 6개월이 지난 버퍼는 사용하면 안 됩니다.
2. 슬라이드를 가열하기 위한 은폐 제거 챔버를 설정합니다. 먼저 챔버 바닥에 수돗물 500mL를 채웁니다. 그런 다음 측면 용기 모두에 수돗물 250mL를 넣고 중앙 용기에 수돗물 200mL를 추가합니다.
3. 5개 슬라이드 메일러에 최대 3개의 슬라이드를 배치합니다.
4. 조직이 완전히 잠길 때까지 슬라이드 메일러에 HIER 버퍼를 채웁니다. 메모: 슬라이드 메일러의 상단에 증기를 배출하고 가압을 방지하기 위해 작은 구멍이 있는지 확인하십시오.
5. 4°C에서 20분 동안 "프로그램 95"를 실행합니다.
6. 한편, 후속 단계를 위해 배양 챔버를 미리 예열합니다(3.5단계 참조).
7. 배양 후 메일러를 제거하고 수도꼭지에서 나오는 찬물이 담긴 욕조에 넣으십시오.
8. 5분 동안 식히십시오.
9. 메일러에서 버퍼의 절반을 제거하고 증류수로 교체하십시오. 5분 동안 식히십시오.
10. 버퍼를 점차적으로 제거하고 물의 양을 두 번씩 5분씩 증가시킵니다.
11. 마지막으로 슬라이드를 100% 증류수로 헹굽니다.

3. 불특정 바인딩 차단

1. 0.1% Triton X-10.
   가 함유된 350uL의 TBS에 10% BSA가 포함된 150uL의 TBS를 첨가하여 차단 완충액(Tris-buffered Saline 또는 TBS, 0.1% Triton X-100, 3% Bovine serum Albumin 또는 BSA)을 준비합니다. 메모: BSA가 10%인 TBS는 -20°C에서 보관되며 매번 신선하게 해동해야 합니다.
2. 슬라이드 메일러 또는 코플린 항아리를 사용하여 TBS, 0.1% 트리톤 X-100에서 5분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다.
3. 메일러에서 슬라이드를 제거하고 Kim 와이프를 사용하여 PAP 원 외부의 버퍼를 제거합니다. ~1분 정도 약간 건조시킵니다.
4. P200을 사용하여 조직을 덮을 만큼만 블로킹 버퍼를 몇 방울 떨어뜨립니다. PAP 라인은 조직 위에 액체를 유지해야 합니다.
   메모: 완충액이 PAP 서클에 국한되지 않는 경우 나중에 항체 손실을 방지하기 위해 조직 주위에 PAP 서클을 다시 그립니다.
5. 슬라이드를 실온의 습도 챔버에서 1시간 동안 배양합니다.
   메모: 빈 피펫 팁 상자는 습도 챔버에 적합합니다. 바닥에 소량의 수돗물이 있는지 확인하십시오.

4. 금속 접합 항체로 염색

1. 4°C에서 금속 접합 항체를 제거하고 10,000 x G에서 1분 동안 원심분리합니다.
2. TBS, 0.1% Triton X-100 및 1% BSA 혼합물에서 항체 마스터 믹스의 최적 희석 준비.
   참고: a) 각 항체의 최적 희석은 실험적으로 결정되어야 하며 성공적인 이미징 질량 세포 분석 실험을 위한 가장 중요한 단계 중 하나입니다. Excel 스프레드시트를 사용하여 토량을 계산합니다. 항체 비용으로 인해 필요한 것보다 약간 더 많이 만드십시오. 예를 들어, 200uL의 블로킹 버퍼가 필요한 경우 250uL 마스터 믹스를 만듭니다. b) 마스터 믹스는 차단 단계 동안 각 실험에 대해 신선하게 준비해야 합니다.
3. 배양 후(3.5단계 참조) 인큐베이터에서 슬라이드를 제거합니다.
4. Kim 물티슈의 슬라이드를 수직 및 수평으로 탭하여 과도한 차단 버퍼를 제거합니다. 이렇게 하면 조직에 약간의 차단 완충액이 남지만 대부분은 제거됩니다.
5. ~1분 정도 약간 건조시킵니다.
6. 슬라이드를 4°C의 습도 챔버에 놓고 평형을 이룹니다.
7. 그런 다음 항체 마스터 믹스를 조직에 조심스럽게 피펫팅하고 용액이 PAP 서클 내에 포함되도록 매우 주의합니다.
8. 습도 챔버를 닫고 4°C에서 밤새 배양합니다.
9. 하룻밤 배양 후 4°C에서 슬라이드를 제거하고 Kim 물티슈를 수직 및 수평으로 두드려 여분의 마스터 믹스를 제거합니다.
10. 우송자 또는 코플린 단지에 있는 활주를 두십시오; 인산염 완충된 식염수 또는 PBS를 가진 5 분 동안 세척하고, 0.2% Triton X-100으로 보충하고, 두번 세척하십시오.
11. 그런 다음 PBS에서 슬라이드를 5분, 두 번 세척합니다. 슬라이드를 제거하고 약 1분 동안 건조시킵니다.

5. DNA 삽입

1. DNA 삽입의 경우 Intercalator-Ir 1:1000을 PBS에서 희석합니다.
2. 희석된 인터컬레이터를 조직에 조심스럽게 피펫으로 삽입하고 용액이 PAP 서클 내에 포함되도록 매우 주의합니다.
3. 차단에 사용되는 습도 챔버에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
4. 그런 다음 Kim 물티슈의 슬라이드를 수직 및 수평으로 두드려 과도한 Intercalator-Ir 염료를 제거합니다.
5. 슬라이드를 메일러 또는 코플린 병에 넣고 HPLC 물로 각각 5분씩 두 번 씻습니다.
6. 스캔하기 전에 건조제에서 슬라이드를 5분 동안 건조시킵니다.

6. 이미지 스캔

1. 슬라이드 스캔의 경우 카바이드 팁 유리 에칭기를 사용하여 슬라이드에 희미한 X 자 4개를 긁습니다. 정확한 티칭 포인트는 최상의 이미지 등록을 가능하게 합니다.
   메모: 가장자리에 너무 가까이 가지 마십시오.
2. 평판 문서 스캐너를 사용하여 인치당 1200도트 이상으로 스캔
3. 이 이미지를 슬라이드 테두리에 최대한 가깝게 자르고 플래시 드라이브에 저장합니다.
4. 이미지 공동 등록의 경우 파일 이름에 "Pre_IMC"가 포함된 Hamamatsu NanoZoomer의 슬라이드를 스캔합니다.

결과

그림 1 : 질량 세포 분석 이미징을 위한 조직 면역염색 절차의 개략도

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
장비
코플린 항아리
통풍구가 있는 플라스틱 5슬라이드 메일러
항원 회수 장치(은폐 제거 챔버)
스캐너
화학 물질 및 효소:
크실렌
200 프루프 에탄올
HPLC 물
Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER 버퍼
증권 시세
0.1% 트리션 X-100이 함유된 TBS
BSA가 10%인 TBS
PBS (PBS)
0.2% Trition X-100을 가진 PBS