방법 논문

총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

DOI:

10.3791/3125

⸱

2011년 11월 13일

 ,  ,  , 
1Center for Sleep and Circadian Biology, Northwestern University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

개별 마우스 뇌 영역의 RNA 발현 프로파일링에는 정확하고 반복 가능한 조직 수집 전략이 필요합니다. 관상동맥 뇌 절편과 조직 코어러 보조 미세박리를 모두 사용하는 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다. 결과 샘플에서 얻은 총 RNA의 수율과 품질은 개략적인 방법의 유용성을 확인합니다.

초록

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기술 플랫폼으로서 차세대 염기서열분석, 마이크로어레이 및 qRT-PCR과 같은 접근 방식은 분자 조절의 폭에 대한 이해를 넓힐 수 있는 큰 가능성을 가지고 있습니다. 고분해능 RNA 염기서열분석(RNA-Seq)1과 같은 새로운 접근법은 상대적 전사체 수준, 선택적 스플라이싱 및 마이크로 RNA2-4와 같은 조직 또는 상태 특이적 발현에 대한 새롭고 광범위한 정보를 제공합니다. 개별조직 내에서 또는 표현형적으로 구별되는 개인 그룹 간의 비교 전체 전사체 프로파일링5에 RNA-Seq 방법을 사용할 수 있는 전망은 정상 및 비정상 생리학적 상태 모두에 관련된 분자 메커니즘을 설명할 수 있는 새로운 방법을 제공합니다. 최근에는 인간의 뇌 조직에 대한 전체 전사체 프로파일링을 수행하여 질병 진행과 관련된 유전자 발현 차이를 확인했습니다6. 그러나 차세대 염기서열분석의 사용은 아직 포유류 연구에 더 널리 통합되지 않았습니다.

마우스 모델의 유전자 발현 연구는 샘플 절제를 위한 레이저 캡처 현미경(LCM)을 사용하여 다양한 뇌 핵 내에서 뚜렷한 프로필을 보고했습니다7,8. LCM은 단일 세포 및 개별 뇌 영역 정밀도로 샘플을 수집할 수 있지만, LCM 접근법의 상대적으로 낮은 총 RNA 수율은 마우스 뇌 조직에서 RNA-Seq 및 기타 프로파일링 접근 방식을 금지할 수 있으며 차선의 샘플 증폭 단계가 필요할 수 있습니다. 여기에서는 개별 마우스 뇌 영역에서 현저해부 및 총 RNA 추출을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 세트 직경 조직 코어러는 개별 마우스 뇌의 750μm 연속 코로나 절편에서 13개 조직을 분리하는 데 사용됩니다. 조직 마이크로펀치 샘플은 즉시 동결되어 보관됩니다. Total RNA는 마그네틱 비드 지원 total RNA 분리 기술을 사용하여 샘플에서 얻습니다. 그 결과로 생성된 RNA 샘플은 다운스트림 발현 프로파일링에 사용할 수 있는 적절한 수율과 품질을 가지고 있습니다. 이 미세해부 전략은 개별 뇌 영역에서 전체 RNA를 얻기 위한 기존 샘플 수집 전략에 실행 가능한 옵션을 제공하여 새로운 유전자 발현 발견의 가능성을 열어줍니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 샘플링 설정 및 준비

  1. Earle의 균형 잡힌 소금 용액(EBSS)에 중탄산나트륨(100mL EBSS당 0.44g)과 포도당(100mL EBSS당 0.884g)을 보충합니다.9. 오토클레이브 가능한 병 또는 나사 상단이 있는 플라스크에서 37°C에서 최소 12시간 동안 DEPC(100mL EBSS당 0.1mL)로 EBSS를 처리합니다.
  2. 5 3/4" 유리 파스퇴르 피펫을 1000mL 유리 비커에 넣고 강모가 위를 향하도록 아티스트의 브러시를 100mL 유리 눈금 실린더에 넣습니다. 피펫과 브러시를 각각 덮을 수 있도록 충분한 DEPC 용액(100mL ddH2O당 0.1mL)을 추가합니다. 비커와 눈금이 매겨진 실린더를 알루미늄 호일로 덮고 37°C에서 최소 12시간 동안 배양합니다.
  3. DEPC로 12시간 배양 후 모든 DEPC 처리 재료를 최소 15분 동안 >100°C의 온도로 가열합니다. EBSS를 제거하고 4 °C에서 보관하기 전에 실온으로 식히십시오. 비커와 눈금이 매겨진 실린더에서 ddH2O를 붓습니다. 재료가 건조 될 때까지 >100 ° C에서 계속 배양하십시오. 제거하고 실온으로 식힌 후 나중에 사용할 수 있도록 보관하십시오.
  4. 실험 당일에는 모든 작업 표면을 RNaseZap으로 처리합니다.
  5. EBSS를 40°C로 설정된 수조에 놓고 유지 관리합니다. EBSS를 완충하고 산소화하려면 RNase-free 파스퇴르 피펫에 가스 튜브를 배치하고 피펫을 EBSS에 삽입하여 95%/5% O2/CO2로 침투시킵니다. EBSS 컨테이너의 입구를 덮습니다.
  6. 뇌 조직의 연속 절편에 사용하기 위해 Stoelting 조직 슬라이서를 설정합니다. 조직 슬라이서의 상단 및 하단 표면을 RNaseZap으로 처리합니다. 직사각형 Whatman #4 여과지 조각을 티슈 초퍼의 플렉시 유리 표면에 부착합니다. 다지기 암에 양날 면도날을 부착합니다. 마이크로미터를 0으로 설정하고 면도날이 여과지를 절단할 수 있지만 플렉시 유리판은 절단할 수 없도록 다지기 암의 최소 높이를 조정합니다.
  7. RNase가 없는 60x15mm 세포 배양 접시, Harris Uni-Core 조직 코어, 마이크로샘플 펀칭 중 코로나 뇌 절편의 EBSS 산소화를 위한 가스 튜브에 부착하기 위한 200μL RNase가 없는 마이크로피펫 팁, 곡선형 가위, 드라이아이스, 조직 채취용 튜브 등 현저해부에 필요한 모든 추가 재료를 수집합니다. 드라이아이스에 튜브를 놓습니다.

2. 뇌 제거 및 관상 절편

  1. 마우스를 DecapiCone에 넣고 설치류 단두대를 사용하여 목을 베십시오. DecapiCone에서 헤드를 제거하고 평평한 표면에 놓습니다. 메스를 사용하여 꼬리에서 콧구멍까지 약 3mm부터 두개골 정중선을 따라 피부를 자릅니다. 피부 덮개를 옆으로 벗겨 두개골과 안와를 노출시킵니다.
  2. 구부러진 가위를 사용하여 양쪽 시신경을 잘라 눈과의 연결을 끊습니다. 후두골과 두정간골을 조심스럽게 부러뜨리고 등쪽 두정골과 전두골을 제거하여 두개강을 엽니다. 뼈 룽거를 사용하여 코뼈와 눈물뼈를 부러뜨려 후각구를 노출시킵니다. 구부러진 가위를 사용하여 뇌에서 후각구를 잘라냅니다. 뒷뇌가 손상되지 않은 상태에서 전체 뇌를 제거합니다. 60 x 15mm의 RNase가 없는 Cellstar 세포 배양 접시의 맨 위에 뇌를 놓습니다. 조직 샘플링 작업 표면으로 이동합니다.
  3. RNase가 없는 피펫을 사용하여 EBSS로 부착된 티슈 다지기에 여과지를 보수적으로 적십니다. EBSS로 뇌 조직을 적십니다.
  4. 뇌를 조직 다지기로 옮기고 적절한 방향을 설정합니다. 참고: 뇌는 복부 표면이 여과지 위에 놓이도록 위치해야 합니다. 정중선(반구 간 균열)은 헬리콥터 블레이드에 수직이어야 하며 뇌의 가장자리는 블레이드와 인접해야 합니다.
  5. DEPC 처리된 아티스트의 브러시를 사용하여 뇌의 등쪽 표면에 부드러운 압력을 가하여 뇌를 고정시킵니다. 뇌를 고정한 상태에서 블레이드 홀더 레버를 등쪽 조직 표면에서 약 4-5cm 위로 들어 올려 이 위치로 유지합니다. 뇌 표면에서 브러시를 제거하고 마이크로미터를 사용하여 750μm를 다이얼합니다. 레버를 떨어뜨려 조직을 자르고 750μm의 관상 단면을 만듭니다.
  6. 다지기 날이 고정되어 있는 동안 아티스트의 브러시로 롤링 동작을 사용하여 날 표면에서 조직 부분을 부드럽게 스와이프합니다. 즉시 조직 단면을 페트리 접시의 산소가 공급된 EBSS에 넣습니다. 두 번째 조사자는 3.1단계에서 시작할 수 있습니다.
  7. 전체 rostro-caudal plane에 걸쳐 연속적인 뇌 절편을 얻을 때까지 2.5단계와 2.6단계를 반복합니다.

3. 뇌 영역 현저해부

  1. 조직 미세해부 중에 샘플 조명이 방해받지 않도록 조명을 조정합니다. 미세 해부 중에 조직에 대한 완충되고 산소가 공급되는 환경을 유지하기 위해 O2/CO2의 95%/5% 혼합물의 위치와 흐름을 조정합니다.
  2. 관심 영역을 포함하는 관상 동맥 뇌 단면을 식별합니다. 아티스트의 브러시를 사용하여 페트리 접시 바닥의 뇌 부분을 평평하게 배치합니다. 표 1 또는 다른 참조를 기반으로 적절한 직경의 조직 코어를 선택합니다. 작가의 브러시로 코로나 조직 부분을 제자리에 고정한 상태에서 조직 코어의 절단 끝을 조직 부분의 표면 위로 가져옵니다.
  3. 압력을 가하는 동안 조직 부분을 통해 조직 코어 팁을 누르고 페트리 접시 바닥에 단단히 누릅니다. 롤링 원형 운동을 사용하여 관심 영역이 주변 조직과 분리되었는지 확인합니다. 조직 코어를 조직 섹션에서 조심스럽게 들어 올리고 마이크로 펀치를 분리하여 EBSS에 떠 있도록 합니다.
  4. 아티스트의 브러시를 사용하여 티슈 마이크로펀치를 드라이아이스에 보관된 -80°C의 안정적인 보관 튜브에 즉시 넣습니다. 조직은 튜브 측면에 쉽게 부착되어야 합니다. 마이크로샘플이 들어있는 튜브를 드라이아이스에 다시 넣습니다.
  5. 관심 있는 각 뇌 영역에 대해 3.2-3.4단계를 반복합니다.

4. 조직 보관

  1. 현미해부가 완료되면 VisionMate 스캐너 시스템을 사용하여 각 샘플이 포함된 TrakMates 튜브에 대한 해당 바코드를 기록합니다. 96슬롯 TrakMates 튜브 랙이 채워지면 랙을 빠르게 스캔하고 RNA가 추출될 때까지 조직 샘플을 -80°C 냉동고에 즉시 넣습니다.

5. 총 RNA 추출

  1. RNaseZap을 사용하여 RNase가 없는 작업 공간을 준비합니다. MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol10에 설명된 대로 충분한 양의 마그네틱 비드 믹스 및 용해/결합 용액을 준비합니다.
  2. -80°C 냉동고에서 티슈 샘플을 꺼내 튜브를 드라이아이스에 직접 놓습니다.
  3. 100 μL의 lysis/Binding Solution을 시료가 함유된 TrakMates 튜브에 추가합니다. 뉴클레아제가 없는 0.5ml 튜브 크기의 유봉을 펠릿 믹서에 부착하고 조직을 균질화합니다. low retention nuclease-free 피펫 팁을 사용하여 균질화된 샘플을 둥근 바닥의 96웰 조직 배양 플레이트의 웰로 옮깁니다. 저잔류 뉴클레아제가 없는 피펫 팁을 사용하여 60μL의 100% 이소프로판올을 시료에 즉시 첨가하고 3-4회 위아래로 파이프를 통해 혼합합니다.
  4. Low retention nuclease-free 피펫 팁을 사용하여 20 μL의 Bead Mix를 시료에 추가합니다. 위아래로 3-4회 파이프를 연결하여 혼합합니다.
  5. 모든 조직 샘플에 대해 5.3-5.4단계를 반복합니다.
  6. III.A.2부터 MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol 단계를 따라 Total RNA 추출을 완료합니다. 메모: 다른 마그네틱 비드 지원 total RNA isolation kit는 상업적으로 이용 가능합니다. 그러나 이 연구에서는 조사되지 않았습니다. 각 제품을 사용한 전체 RNA 분리에 대한 자세한 내용은 제조업체의 키트 설명서를 참조하십시오.
  7. NanoDrop 3300 분광광도계 또는 기타 소량 분광광도계/형광측정기 기술을 사용하여 생성된 총 RNA의 순도와 농도를 측정합니다.

6. 대표 결과:

<테이블 테두리="1"> 뇌 영역/핵 조직 Corer 직경 (mm) 총 RNA (ng/μL) 260/280 비율 전두엽 피질 2.0 27월 3일 1.99 호 핵 Accumbens 1.0 호 6.26호 2.77 호 선조체 1.5 27.94분 2.19 호 대상피질 1.5 29.05분 2.07월 시상하부(Hypothalamus) - 뇌실주위핵(Paraventricular Nucleus / Suprachiasmatic Nucleus) (PVN/SCN) 2.0 40.34분 2.03년 시상 2.0 34.40분 2.00분 시상하부(Hypothalamus) - 배측핵(Dorsomedial nucleus) / 복내측핵(ventromedial nucleus, DMH/VMH) 2.0 44.83분 2.05월 편도 1.0 호 10월 6일 1.89 호 해마 - ca 2/3 1.5 7.31호 2.32년 해마 - Ca1/Dentate Gyrus 1.5 5월 20일 2.24 호 Periaqueductal 그레이 1.0 호 48.21년 2.02년 등쪽 Raphe 핵 1.0 호 6.56분 2.18 호 망상 형성 2.0 35.35분 2.27 호

표 1. 각각의 최적 조직 코어러 직경, 대표적인 총 RNA 수율 및 순도를 가진 미세절개된 마우스 뇌 영역의 열거. 주엽-꼬리 순서로 나열된 13개의 미세절부 뇌 영역은 크기와 방향이 다양합니다. PVN/SCN 마이크로펀치는 전내측 뇌실주위핵(anteromedial paraventricular nucleus), 뇌실주위핵(periventricular nucleus)의 일부, 뇌실하부영역(subparaventricular zone) 및 기타 뇌실하세포(parvocellular neuron)를 포함한다. 시상 마이크로펀치는 PVN/SCN 마이크로펀치 영역과 동일한 관상평면에 위치한 전방 시상핵을 포함합니다. DMH/VMH 마이크로펀치는 부속 목세포핵(accessory magnocellular nuclei)과 배측측핵(dorsomedial nucleus)과 복내측핵(ventromedial nucleus) 사이에 위치한 기타 파보세포핵(parvocellular nuclen)을 포함합니다. 편도체 샘플에는 중앙 및 기저 외측 하위 영역이 모두 포함됩니다. RNA 수율 및 260/280 비율은 각 뇌 영역에서 얻은 판독값을 보여주기 위해 각 현미해부 샘플에서 얻은 단일 값입니다.

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토론

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이 프로토콜에는 세심한 주의와 고려가 필요한 많은 중요한 단계가 있습니다. 관심 있는 각 영역을 제거하기 위해 적절한 조직 코어러 직경의 선택을 결정해야 합니다. 표 1에 제시된 조직 코어러 직경은 나열된 뇌 영역의 수집에 적합하지만 각 조사자는 각각의 관심 조직(들)의 최적 수집을 위해 적절한 크기의 조직 코어러를 결정해야 합니다. 둘째, 이 방법으로 보고된 관상 단면 두께(750μm)는 다양한 유전적 배경을 가진 성체 마우스에서 관심 뇌 영역(표 1)을 식별하는 데 최적이라고 실험적으로 결정되었습니다. 신경해부학적 랜드마크는 각 관심 영역의 경계를 확인하는 데 사용되며 개별 동물마다 다르지 않습니다. 조직 두께는 수정될 수 있습니다. 그러나 500μm 미만의 절편 두께를 선택하면 이 미세 해부 방법의 유용성을 손상시키는 기술적 문제가 발생합니다. 마지막으로, 동물의 참수와 뇌 절편 완료 사이의 최적 시간은 5분입니다. 이때까지 모든 관상 뇌 절편은 산소가 공급된 EBSS 배지에 있어야...

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공개 사항

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이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 국방고등연구계획국(DARPA)과 육군 연구실(ARO)의 지원을 받았으며 수상 번호는 W911NF-10-1-006입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Isotemp 102 수조Fisher Scientific15-460-3Q
RNase ZapAmbionAM9782
Lab rotator (orbital shaker)Thermo Fisher Scientific, Inc.2314 –- 1CEQ
펠렛 믹서VWR international47747-370
RNase-free 0.5 mL 유봉VWR internationalKT749521-0590Nuclease-free
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)Sigma-AldrichD5758-50ML
양면 면도날Stoelting Co.51427
세인트– 수동 마이크로미터가 있는 lting 조직 슬라이서Stoelting Co.51425
2/0 라운드 아티스트 S 브러쉬프린스턴 아트 브러쉬4350R
해리스 유니 코어 티슈 코어 (0.75 mm)Ted Pella, Inc.15072
해리스 유니 코어 티슈 코어러 (1.0 mm)Ted Pella, Inc.15099
해리스 유니 코어 티슈 코어(1.5mm)Ted Pella, Inc.15075
해리스 유니 코어 티슈 코어러 (2.0 mm)Ted Pella, Inc.15076
단두대Braintree Scientific, Inc.RG-100
DecapiConesBraintree 사이언티픽, Inc.MDC-200
하이클론 얼 s 균형 잡힌 염 용액(EBSS)Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30029.02
25 mL 피펫Corning4489뉴클레아제 무함유
epT.I.P.S. LoRetention Dualfilter 피펫 팁, 20 — 300 &뮤; LEppendorf0030 077.636
TrakMates 캡이 있는 스크류 탑 튜브Thermo Fisher Scientific, Inc.3741
VisionMate 무선 2D 바코드 리더Thermo Fisher Scientific, Inc.3122MTX
VisionMate SR 싱글 랙 2D 바코드 리더Thermo Fisher Scientific, Inc.3115
1-200 &뮤; L 범용 핏 피펫 팁Corning4864뉴클레아제가 없는
Cellstar 세포 배양 접시Greiner Bio-One628160뉴클레아제가 없는
Greiner Bio-One 96웰 폴리스티렌 Cellstar 조직 배양 플레이트, U-bottomUSA Scientific, Inc.5665-0180뉴클레아제 무함유
4 여과지Whatman, GE Healthcare1004 150
실리콘 전구형 안전 피펫 필러Fisher Scientific13-681-102A
NanoDrop 3300 분광 광도계Thermo Fisher Scientific, Inc.노스다코타-3300
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참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
  2. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
  3. Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
  4. Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
  5. Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
  6. Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
  7. Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
  8. Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
  9. Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
  10. Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.

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