마우스 뇌의 특정 영역별 RNA 발현 프로파일링을 위해서는 정밀하고 재현 가능한 조직 수집 전략이 필요합니다. 본 문서에서는 관상면 뇌 절단과 조직 코어러(corer) 보조 미세 절제술을 모두 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 결과 샘플에서 얻은 총 RNA의 수율과 품질은 상술한 방법의 유용성을 입증합니다.
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방법 논문
총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법
이 논문에서
요약
초록
차세대 염기서열 분석, 마이크로어레이 및 qRT-PCR과 같은 기술적 플랫폼 기반의 접근 방식은 분자 조절의 광범위한 영역에 대한 이해를 확장하는 데 큰 가능성을 가지고 있습니다. 고해상도 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)1과 같은 최신 접근 방식은 상대적 전사체 수준, 선택적 스플라이싱 및 마이크로 RNA2-4와 같이 조직 또는 상태 특이적 발현에 대한 새롭고 광범위한 정보를 제공합니다. 특정 조직 내 또는 표현형이 뚜렷하게 구분되는 개체군 간의 비교 전전사체 프로파일링5에 RNA-Seq 방법을 적용하는 전망은 정상 및 비정상적 생리 상태 모두에 관여하는 분자 기전을 규명하는 새로운 경로를 제공합니다. 최근 인간 뇌 조직을 대상으로 전전사체 프로파일링이 수행되어 질병 진행과 관련된 유전자 발현 차이가 확인되었습니다6. 하지만 차세대 염기서열 분석의 활용은 포유류 연구에 아직 더 널리 통합되지 않은 상태입니다.
마우스 모델을 이용한 유전자 발현 연구에서는 시료 절제를 위해 레이저 캡처 미세해부법(LCM)을 사용하여 다양한 뇌핵 내에서 뚜렷한 프로파일을 보고한 바 있습니다7,8. LCM은 단일 세포 및 개별 뇌 영역 수준의 정밀한 시료 수집이 가능하지만, LCM 방식으로는 전체 RNA 수득량이 상대적으로 낮아 마우스 뇌 조직의 RNA-Seq 및 기타 프로파일링 접근법을 적용하기 어려울 수 있으며, 최적이 아닌 시료 증폭 단계가 필요할 수 있습니다. 본 연구에서는 마우스 뇌의 개별 영역에서 미세해부 및 전체 RNA를 추출하는 프로토콜을 제시합니다. 직경이 고정된 조직 코어러(tissue corer)를 사용하여 개별 마우스 뇌의 750-μm 연속 관상절편으로부터 13종의 조직을 분리합니다. 조직 마이크로펀치 시료는 즉시 냉동 및 보관됩니다. 전체 RNA는 자기 비드 기반의 전체 RNA 분리 기술을 사용하여 시료로부터 얻습니다. 결과적으로 얻은 RNA 시료는 후속 발현 프로파일링에 사용하기에 충분한 수득량과 품질을 갖추고 있습니다. 이러한 미세해부 전략은 개별 뇌 영역에서 전체 RNA를 얻기 위한 기존의 시료 수집 전략에 실질적인 대안을 제공하며, 새로운 유전자 발현 발견의 가능성을 열어줍니다.
프로토콜
1. 샘플링 설정 및 준비
- Earle's balanced salt solution(EBSS)에 중탄산나트륨(EBSS 100 mL당 0.44 g)과 포도당(EBSS 100 mL당 0.884 g)을 첨가한다9. 나사 캡이 있는 오토클레이브 가능 병 또는 플라스크에 EBSS를 넣고 DEPC(EBSS 100 mL당 0.1 mL)로 37 °C에서 최소 12시간 동안 처리한다.
- 5 ¾" 유리 파스퇴르 피펫을 1000 mL 유리 비커에 넣고, 브러시 모가 위를 향하도록 하여 미술용 붓을 100 mL 유리 메스실린더에 넣는다. 피펫과 붓이 각각 충분히 잠기도록 DEPC 용액(ddH2O 100 mL당 0.1 mL)을 추가한다. 비커와 메스실린더를 알루미늄 호일로 덮고 37 °C에서 최소 12시간 동안 배양한다.
- DEPC로 12시간 배양한 후, DEPC 처리된 모든 재료를 100 °C >의 온도로 최소 15분 동안 가열한다. EBSS를 꺼내 실온으로 식힌 후 4 °C에서 보관한다. 비커와 메스실린더에서 ddH2O를 따라 버리고, 재료가 마를 때까지 100 °C >에서 계속 가열한다. 재료를 꺼내 실온으로 식힌 후 추후 사용을 위해 보관한다.
- 실험 당일에 모든 작업 표면을 RNaseZap으로 처리한다.
- EBSS를 40 °C로 설정된 항온수조에 넣고 유지한다. EBSS를 완충 및 산소화하기 위해, 가스 튜브를 RNase-free 파스퇴르 피펫에 넣고 이 피펫을 EBSS에 삽입하여 95%/5% O2/CO2를 주입한다. EBSS 용기의 입구를 덮는다.
- 뇌 조직의 연속 절편 제작을 위해 Stoelting 조직 절편기를 설정한다. 조직 절편기의 상단과 하단 표면을 RNaseZap으로 처리한다. Whatman #4 거름종이를 직사각형으로 잘라 조직 절편기의 플렉시글라스 표면에 부착한다. 양날 면도날을 절편기 암(arm)에 부착한다. 마이크로미터를 0으로 설정하고, 면도날이 거름종이는 자르되 플렉시글라스 판은 자르지 않도록 절편기 암의 최소 높이를 조정한다.
- RNase-free 60x15 mm 세포 배양 접시, Harris Uni-Core 조직 코어러, 마이크로샘플 펀칭 중 관상 뇌 절편의 EBSS 산소화를 위해 가스 튜브에 부착할 200 μL RNase-free 마이크로피펫 팁, 곡선 가위, 드라이아이스, 조직 수집용 튜브를 포함하여 미세 해부에 필요한 모든 추가 재료를 준비한다. 튜브를 드라이아이스 위에 놓는다.
2. 뇌 적출 및 관상면 절단
- 마우스를 DecapiCone에 넣고 설치류용 기요틴을 사용하여 안락사(참수)시킵니다. DecapiCone에서 머리를 꺼내 평평한 표면에 놓습니다. 메스를 사용하여 콧구멍에서 약 3 mm 후측 지점부터 두개골 정중선을 따라 피부를 절개합니다. 피부 플랩을 측면으로 젖혀 두개골과 안와를 노출시킵니다.
- 곡선 가위를 사용하여 양측 시신경을 절단해 눈과의 연결을 끊습니다. 후두골과 간두정골을 조심스럽게 부수고 등쪽의 두정골과 전두골을 제거하여 두개강을 엽니다. 골절삭기를 사용하여 비골과 누골을 부수어 후각구(olfactory bulbs)를 노출시킵니다. 곡선 가위로 후각구를 뇌의 전측 부위에서 잘라냅니다. 후뇌(hindbrain)가 온전한 상태에서 뇌 전체를 제거합니다. 뇌를 60 x 15 mm 크기의 RNase-free Cellstar 세포 배양 접시 상단에 놓습니다. 이를 조직 샘플링 작업대로 옮깁니다.
- RNase-free 피펫을 사용하여 조직 절단기(tissue chopper)에 부착된 필터 페이퍼를 EBSS로 조심스럽게 적십니다. 뇌 조직을 EBSS로 적십니다.
- 뇌를 조직 절단기로 옮기고 적절한 방향으로 배치합니다. 참고: 뇌의 복측 표면이 필터 페이퍼에 닿도록 배치해야 합니다. 정중선(대뇌반구간열)은 절단기 칼날과 수직이 되어야 하며, 뇌의 전측 가장자리가 칼날에 밀착되어야 합니다.
- DEPC 처리된 미술용 붓을 사용하여 뇌의 등쪽 표면에 가벼운 압력을 가해 뇌를 고정합니다. 뇌를 고정한 상태에서 칼날 홀더 레버를 조직 표면 위로 약 4-5 cm 들어 올려 그 상태로 유지합니다. 뇌 표면에서 붓을 떼고, 마이크로미터를 사용하여 750 μm로 맞춥니다. 레버를 내려 조직을 절단하여 750 μm 두께의 관상 단면(coronal section)을 생성합니다.
- 절단기 칼날이 정지된 상태에서 미술용 붓을 굴리듯 움직여 조직 절편을 칼날 표면에서 조심스럽게 밀어냅니다. 조직 절편을 즉시 페트리 접시에 담긴 산소 공급 EBSS에 넣습니다. 제2 연구자는 3.1단계부터 작업을 시작할 수 있습니다.
- 전체 전-후축 평면(rostro-caudal plane)에 걸쳐 연속적인 뇌 절편을 얻을 때까지 2.5단계와 2.6단계를 반복합니다.
3. 뇌 영역 미세해부
- 조직 미세절단 과정 중 시료 조명이 가려지지 않도록 조명을 조절합니다. 미세절단 동안 조직이 완충된 산소 공급 환경을 유지할 수 있도록 95%/5% 혼합 O2/CO2의 위치와 유량을 조절합니다.
- 관심 영역이 포함된 뇌의 관상면 절편을 확인합니다. 미술용 붓을 사용하여 뇌 절편을 페트리 접시 바닥에 평평하게 놓습니다. 표 1 또는 다른 참고 문헌을 바탕으로 적절한 직경의 조직 코러(tissue corer)를 선택합니다. 미술용 붓으로 관상면 조직 절편을 고정한 상태에서 조직 코러의 절단 팁을 조직 절편 표면 위로 내립니다.
- 압력을 가하면서 조직 코러 팁을 조직 절편을 관통하여 페트리 접시 바닥까지 단단히 누릅니다. 원을 그리듯 굴리는 동작을 사용하여 관심 영역이 주변 조직으로부터 완전히 분리되었는지 확인합니다. 조직 코러를 조직 절편에서 조심스럽게 들어 올려 마이크로펀치(micropunch)를 분리하여 EBSS에 띄웁니다.
- 미술용 붓을 사용하여 조직 마이크로펀치를 드라이아이스 위에 보관된 -80 °C 안정 저장 튜브에 즉시 넣습니다. 조직은 튜브 벽면에 쉽게 부착되어야 합니다. 미세 시료가 담긴 튜브를 다시 드라이아이스 위에 놓습니다.
- 각 관심 뇌 영역에 대해 3.2단계에서 3.4단계까지의 과정을 반복합니다.
4. 조직 보관
- 미세절단이 완료되면 VisionMate 스캐너 시스템을 사용하여 각 샘플이 담긴 TrakMates 튜브의 바코드를 기록합니다. 96슬롯 TrakMates 튜브 랙이 모두 채워지면 랙을 빠르게 스캔하고, RNA 추출 전까지 조직 샘플을 즉시 -80 °C 냉동고에 보관합니다.
5. 총 RNA 추출
- RNaseZap을 사용하여 RNase-free 작업 공간을 준비합니다. MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol10에 기술된 대로 충분한 양의 magnetic Bead Mix와 Lysis/Binding Solution을 준비합니다.
- -80 °C 냉동고에서 조직 샘플을 꺼내 튜브를 즉시 드라이아이스 위에 놓습니다.
- 샘플이 들어 있는 TrakMates 튜브에 Lysis/Binding Solution 100 μL를 첨가합니다. 펠렛 믹서에 nuclease-free 0.5 ml 튜브 크기의 페스틀을 부착하고 조직을 균질화합니다. low-retention nuclease-free 피펫 팁을 사용하여 균질화된 샘플을 라운드 바텀 96-well 조직 배양 플레이트의 웰로 옮깁니다. 즉시 low retention nuclease-free 피펫 팁을 사용하여 샘플에 100% isopropanol 60 μL를 첨가하고, 피펫팅을 3-4회 반복하여 혼합합니다.
- low retention nuclease-free 피펫 팁을 사용하여 샘플에 Bead Mix 20 μL를 첨가합니다. 피펫팅을 3-4회 반복하여 혼합합니다.
- 모든 조직 샘플에 대해 단계 5.3-5.4를 반복합니다.
- total RNA 추출을 완료하기 위해 III.A.2부터 시작하는 MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol 단계를 따릅니다. 참고: 다른 자성 비드 기반 total RNA 분리 키트들이 시판되고 있으나, 본 연구에서는 검토되지 않았습니다. 해당 제품을 이용한 total RNA 분리의 상세 내용은 제조사의 키트 매뉴얼을 참조하십시오.
- NanoDrop 3300 분광광도계 또는 기타 소량 분광광도계/형광광도계 기술을 사용하여 얻어진 total RNA의 순도와 농도를 측정합니다.
6. 대표 결과:
| 뇌 영역/핵 | 조직 코어러 직경 (mm) | 총 RNA (ng/μL) | 260/280 비율 |
| 전두엽 피질 | 2.0 | 27.03 | 1.99 |
| 측좌핵 | 1.0 | 6.26 | 2.77 |
| 줄무늬체 | 1.5 | 27.94 | 2.19 |
| 대상피질 | 1.5 | 29.05 | 2.07 |
| 시상하부 - 뇌실주위핵 / 시교차상핵 (PVN/SCN) | 2.0 | 40.34 | 2.03 |
| 시상 | 2.0 | 34.40 | 2.00 |
| 시상하부 - 배내측핵 / 복내측핵 (DMH/VMH) | 2.0 | 44.83 | 2.05 |
| 편도체 | 1.0 | 10.06 | 1.89 |
| 해마 - Ca 2/3 | 1.5 | 7.31 | 2.32 |
| 해마 - Ca1/치상회 | 1.5 | 5.20 | 2.24 |
| 중뇌수도 주변 회백질 | 1.0 | 48.21 | 2.02 |
| 배측 솔기핵 | 1.0 | 6.56 | 2.18 |
| 망상체 | 2.0 | 35.35 | 2.27 |
표 1. 미세절제된 마우스 뇌 영역별 최적 조직 코어 직경, 대표 총 RNA 수율 및 순도 목록. 전-후 방향 순으로 나열된 13개의 미세절제 뇌 영역은 크기와 방향이 다양하다. PVN/SCN 마이크로펀치는 전내측 시상하부 뇌실곁핵, 뇌실주위핵의 일부, 뇌실곁하대 및 기타 소세포 뉴런을 포함한다. 시상 마이크로펀치는 PVN/SCN 마이크로펀치 영역과 동일한 관상면(coronal plane)에 위치한 전시상핵들을 포함한다. DMH/VMH 마이크로펀치는 등내측핵과 복내측핵 사이에 위치한 부대망상핵 및 기타 소세포 뉴런을 포함한다. 편도체 샘플은 중심핵과 기저외측 하영역을 모두 포함한다. RNA 수율과 260/280 비율은 각 뇌 영역에서 얻은 측정값을 보여주기 위해 각각의 미세절제 샘플에서 얻은 단일 값이다.
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토론
본 프로토콜에는 세심한 주의와 고려가 필요한 여러 중요한 단계가 있습니다. 각 관심 영역을 제거하기 위해 적절한 조직 코어러(tissue corer)의 직경을 결정해야 합니다. 표 1에 제시된 조직 코어러 직경은 나열된 뇌 영역 수집에 적합하지만, 각 연구자는 자신의 관심 조직을 최적으로 수집하기 위해 적절한 크기의 조직 코어러를 결정해야 합니다. 둘째로, 본 방법에서 보고된 관상면 절편 두께(750 μm)는 다양한 유전적 배경을 가진 성체 마우스의 관심 뇌 영역(표 1)을 식별하는 데 최적인 것으로 실험적으로 결정되었습니다. 신경해부학적 표지는 각 관심 영역의 경계를 확인하는 데 사용되며, 개별 동물 간에 차이가 없습니다. 조직 두께는 수정될 수 있으나, 절편 두께를 500 μm 미만으로 선택할 경우 본 미세해부 방법의 유용성을 저해하는 기술적 어려움이 발생합니다. 마지막으로, 동물 안락사(decapitation) 후 뇌 절편 제작 완료까지의 최적 시간은 5분입니다. 이 시간까지 모든 관상면 뇌 ...
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공개 사항
선언된 이해관계의 충돌 없음.
감사의 글
본 연구는 방위고등연구계획국(DARPA)과 육군연구소(ARO)의 지원을 받았으며, 과제 번호는 W911NF-10-1-006입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Isotemp 102 항온수조 | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| 실험실 회전기(오비탈 셰이커) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314 –- 1CEQ | |
| 펠릿 믹서 | VWR international | 47747-370 | |
| RNase-free 0.5 mL 유발 | VWR international | KT749521-0590 | 뉴클레아제-프리 |
| 디에틸 파이로카보네이트 (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-50ML | |
| 양날 면도날 | Stoelting Co. | 51427 | |
| St–수동 마이크로미터가 장착된 조직 절편기 | Stoelting Co. | 51425 | |
| 2/0 라운드 아티스트 붓’s 브러시 | 프린스턴 아트 브러시 | 4350R | |
| Harris Uni-Core 조직 코어러 (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Harris Uni-Core 조직 코러 (1.0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| Harris Uni-Core 조직 코어러 (1.5 mm) | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| Harris Uni-Core 조직 코어러 (2.0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| 길로틴 절단기 | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| 데카피콘(DecapiCones) | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| HyClone Earle’균형염 용액(EBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30029.02 | |
| 25 mL 피펫 | Corning | 4489 | 뉴클레아제 제거(Nuclease-free) |
| epT.I.P.S. 저흡착 듀얼필터 피펫 팁, 20$\mu$L — 300 μL | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| 캡이 포함된 TrakMates 스크류 캡 튜브 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3741 | |
| VisionMate 무선 2D 바코드 판독기 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3122MTX | |
| VisionMate SR 싱글 랙 2D 바코드 리더기 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3115 | |
| 1-200 μL 범용 피펫 팁 | Corning | 4864 | 뉴클레아제 제거 |
| Cellstar 세포 배양 접시 | Greiner Bio-One | 628160 | 뉴클레아제 프리 |
| Greiner Bio-One 96-웰 폴리스티렌 Cellstar 조직 배양 플레이트, U-바닥 | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | 뉴클레아제 프리 |
| #4 거름종이 | Whatman, GE Healthcare | 1004 150 | |
| 실리콘 벌브형 안전 피펫 필러 | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| NanoDrop 3300 분광광도계 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
참고문헌
- Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
- Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
- Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
- Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
- Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
- Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
- Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.
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재인쇄 및 허가
