방법 논문

총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

DOI:

10.3791/3125

⸱

2011년 11월 13일

 ,  ,  , 
1Center for Sleep and Circadian Biology, Northwestern University

이 논문에서

요약

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개별 마우스 뇌 영역의 RNA 발현 프로파일링에는 정확하고 반복 가능한 조직 수집 전략이 필요합니다. 관상동맥 뇌 절편과 조직 코어러 보조 미세박리를 모두 사용하는 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다. 결과 샘플에서 얻은 총 RNA의 수율과 품질은 개략적인 방법의 유용성을 확인합니다.

초록

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기술 플랫폼으로서 차세대 염기서열분석, 마이크로어레이 및 qRT-PCR과 같은 접근 방식은 분자 조절의 폭에 대한 이해를 넓힐 수 있는 큰 가능성을 가지고 있습니다. 고분해능 RNA 염기서열분석(RNA-Seq)1과 같은 새로운 접근법은 상대적 전사체 수준, 선택적 스플라이싱 및 마이크로 RNA2-4와 같은 조직 또는 상태 특이적 발현에 대한 새롭고 광범위한 정보를 제공합니다. 개별조직 내에서 또는 표현형적으로 구별되는 개인 그룹 간의 비교 전체 전사체 프로파일링5에 RNA-Seq 방법을 사용할 수 있는 전망은 정상 및 비정상 생리학적 상태 모두에 관련된 분자 메커니즘을 설명할 수 있는 새로운 방법을 제공합니다. 최근에는 인간의 뇌 조직에 대한 전체 전사체 프로파일링을 수행하여 질병 진행과 관련된 유전자 발현 차이를 확인했습니다6. 그러나 차세대 염기서열분석의 사용은 아직 포유류 연구에 더 널리 통합되지 않았습니다.

마우스 모델의 유전자 발현 연구는 샘플 절제를 위한 레이저 캡처 현미경(LCM)을 사용하여 다양한 뇌 핵 내에서 뚜렷한 프로필을 보고했습니다7,8. LCM은 단일 세포 및 개별 뇌 영역 정밀도로 샘플을 수집할 수 있지만, LCM 접근법의 상대적으로 낮은 총 RNA 수율은 마우스 뇌 조직에서 RNA-Seq 및 기타 프로파일링 접근 방식을 금지할 수 있으며 차선의 샘플 증폭 단계가 필요할 수 있습니다. 여기에서는 개별 마우스 뇌 영역에서 현저해부 및 총 RNA 추출을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 세트 직경 조직 코어러는 개별 마우스 뇌의 750μm 연속 코로나 절편에서 13개 조직을 분리하는 데 사용됩니다. 조직 마이크로펀치 샘플은 즉시 동결되어 보관됩니다. Total RNA는 마그네틱 비드 지원 total RNA 분리 기술을 사용하여 샘플에서 얻습니다. 그 결과로 생성된 RNA 샘플은 다운스트림 발현 프로파일링에 사용할 수 있는 적절한 수율과 품질을 가지고 있습니다. 이 미세해부 전략은 개별 뇌 영역에서 전체 RNA를 얻기 위한 기존 샘플 수집 전략에 실행 가능한 옵션을 제공하여 새로운 유전자 발현 발견의 가능성을 열어줍니다.

프로토콜

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1. 샘플링 설정 및 준비

  1. Earle의 균형 잡힌 소금 용액(EBSS)에 중탄산나트륨(100mL EBSS당 0.44g)과 포도당(100mL EBSS당 0.884g)을 보충합니다.9. 오토클레이브 가능한 병 또는 나사 상단이 있는 플라스크에서 37°C에서 최소 12시간 동안 DEPC(100mL EBSS당 0.1mL)로 EBSS를 처리합니다.
  2. 5 3/4" 유리 파스퇴르 피펫을 1000mL 유리 비커에 넣고 강모가 위를 향하도록 아티스트의 브러시를 100mL 유리 눈금 실린더에 넣습니다. 피펫과 브러시를 각각 덮을 수 있도록 충분한 DEPC 용액(100mL ddH2O당 0.1mL)을 추가합니다. 비커와 눈금이 매겨진 실린더를 알루미늄 호일로 덮고 37°C에서 최소 12시간 동안 배양합니다.
  3. DEPC로 12시간 배양 후 모든 DEPC 처리 재료를 최소 15분 동안 >100°C의 온도로 가열합니다. EBSS를 제거하고 4 °C에서 보관하기 전에 실온으로 식히십시오. 비커와 눈금이 매겨진 실린더에서 ddH2O를 붓습니다. 재료가 건조 될 때까지 >100 ° C에서 계속 배양하십시오. 제거하고 실온으로 식힌 후 나중에 사용할 수 있도록 보관하십시오.
  4. 실험 당일에는....

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토론

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이 프로토콜에는 세심한 주의와 고려가 필요한 많은 중요한 단계가 있습니다. 관심 있는 각 영역을 제거하기 위해 적절한 조직 코어러 직경의 선택을 결정해야 합니다. 표 1에 제시된 조직 코어러 직경은 나열된 뇌 영역의 수집에 적합하지만 각 조사자는 각각의 관심 조직(들)의 최적 수집을 위해 적절한 크기의 조직 코어러를 결정해야 합니다. 둘째, 이 방법으로 보고된 관상 단면 두께(750μm)는 다양한 유전적 배경을 가진 성체 마우스에서 관심 뇌 영역(표 1)을 식별하는 데 최적이라고 실험적으로 결정되었습니다. 신경해부학적 랜드마크는 각 관심 영역의 경계를 확인하는 데 사용되며 개별 동물마다 다르지 않습니다. 조직 두께는 수정될 수 있습니다. 그러나 500μm 미만의 절편 두께를 선택하면 이 미세 해부 방법의 유용성을 손상시키는 기술적 문제가 발생합니다. 마지막으로, 동물의 참수와 뇌 절편 완료 사이의 최적 시간은 5분입니다. 이때까지 모든 관상 뇌 절편은 산소가 공급된 EBSS 배지에 있어야.......

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공개 사항

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이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

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이 작업은 국방고등연구계획국(DARPA)과 육군 연구실(ARO)의 지원을 받았으며 수상 번호는 W911NF-10-1-006입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Isotemp 102 수조Fisher Scientific15-460-3Q
RNase ZapAmbionAM9782
Lab rotator (orbital shaker)Thermo Fisher Scientific, Inc.2314 –- 1CEQ
펠렛 믹서VWR international47747-370
RNase-free 0.5 mL 유봉VWR internationalKT749521-0590Nuclease-free
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)Sigma-AldrichD5758-50ML
양면 면도날Stoelting Co.51427
세인트– 수동 마이크로미터가 있는 lting 조직 슬라이서Stoelting Co.51425
2/0 라운드 아티스트 S 브러쉬프린스턴 아트 브러쉬4350R
해리스 유니 코어 티슈 코어 (0.75 mm)Ted Pella, Inc.15072
해리스 유니 코어 티슈 코어러 (1.0 mm)Ted Pella, Inc.15099
해리스 유니 코어 티슈 코어(1.5mm)Ted Pella, Inc.15075
해리스 유니 코어 티슈 코어러 (2.0 mm)Ted Pella, Inc.15076
단두대Braintree Scientific, Inc.RG-100
DecapiConesBraintree 사이언티픽, Inc.MDC-200
하이클론 얼 s 균형 잡힌 염 용액(EBSS)Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30029.02
25 mL 피펫Corning4489뉴클레아제 무함유
epT.I.P.S. LoRetention Dualfilter 피펫 팁, 20 — 300 &뮤; LEppendorf0030 077.636
TrakMates 캡이 있는 스크류 탑 튜브Thermo Fisher Scientific, Inc.3741
VisionMate 무선 2D 바코드 리더Thermo Fisher Scientific, Inc.3122MTX
VisionMate SR 싱글 랙 2D 바코드 리더Thermo Fisher Scientific, Inc.3115
1-200 &뮤; L 범용 핏 피펫 팁Corning4864뉴클레아제가 없는
Cellstar 세포 배양 접시Greiner Bio-One628160뉴클레아제가 없는
Greiner Bio-One 96웰 폴리스티렌 Cellstar 조직 배양 플레이트, U-bottomUSA Scientific, Inc.5665-0180뉴클레아제 무함유
4 여과지Whatman, GE Healthcare1004 150
실리콘 전구형 안전 피펫 필러Fisher Scientific13-681-102A
NanoDrop 3300 분광 광도계Thermo Fisher Scientific, Inc.노스다코타-3300
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참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
  2. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotec....

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