투과 전자 현미경을 사용한 마우스 뇌 절편의 초구조 분석

Abstract

출처: Lutz, D., et.al. 발달 중인 마우스 뇌 및 척수의 자궁 내 전달 후 초구조적 신경 가소성 매개변수의 평가. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 새끼 쥐의 뇌 절편에 대한 준비 및 투과 전자 현미경(TEM) 분석을 보여줍니다. 이 프로토콜은 수지에 내장된 오스뮴 테트록사이드 고정 조직으로 시작하여 관심 영역을 분리하기 위한 정밀한 트리밍과 초박형 절개술을 통해 각각 광학 현미경 및 TEM을 사용하여 시각화된 반박형 및 초박형 절편을 생성합니다.

Protocol

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 정량 분석을 위한 초구조적 신경가소성 매개변수 선택

1. 관심 영역 매핑
   1. 관심 영역(예: 해마 또는 소뇌)을 선택하고 이 영역을 포함하는 아틀라스에서 이미지를 선택하여 섹션 아틀라스에서 영역을 지역화합니다.
   2. 관심 영역의 경계를 단면 이미지에 스케치하고 이러한 영역 경계를 수지 표본에 찾거나 겹칩니다.
   3. 미세 바늘 게이지(26G, 1인치)를 사용하여 수지 표본의 관심 영역(예: 해마 또는 소뇌)의 경계를 긁어 표시합니다.
   4. 오븐에서 수지 표본을 85°C로 가열하여 트리밍을 위해 레진을 부드럽게 하거나 트리밍 장치, 얇은 블레이드 또는 사포를 사용합니다.
   5. 면도날로 수지 표본에서 관심 영역을 절제합니다. 접착제로 필요한 구경(예: 직경 8mm, 길이 1cm)의 아크릴 유리 막대에 표본을 장착합니다. 반박형 및 초박형 절편을 위해 장착된 시편을 다듬습니다.
   6. 초박 절편기를 사용하여 트리밍된 영역의 반박형(0.75μm) 및 초박형(70nm) 절편을 준비합니다: 0.75μm 두께의 경우 1.5mm/s, 70nm 두께의 경우 0.7mm/s로 설정합니다.
   7. 유리 캐리어에서 반박형 부분을 수집하고 PBS에서 1% 톨루이딘 블루로 섹션을 염색합니다(4분 동안).
   8. 탈이온수로 섹션을 여러 번 씻으십시오. 4x(개구수 0.1 ∞/-), 10배(개구수 0.22 ∞/0.17), 40배(개구수 0.65 ∞/0.17) 및 100배(개구수 1.25 ∞/0.17) 대물렌즈를 사용하여 광학 현미경으로 염색된 부분을 검사합니다.
   9. 니켈 그리드에서 초박형 섹션을 수집합니다. 그리드를 180kV 및 3,200x, 6,000x 및/또는 8,000x 배율에서 TEM으로 적용합니다.
2. TEM 분석
   1. 정량적 TEM 분석을 위해 관심 있는 초미세 구조 매개변수(예: 소포 및 미토콘드리아가 있는 부톤 또는 수초화 및 비수초화 축삭돌기)를 선택하고 3,500배, 6,000배 및/또는 8,000배 배율에서 이러한 매개변수의 TEM 이미지를 촬영합니다.
   위치

Materials