투과 전자 현미경 이미징 마우스 해마 뉴런에서 시냅스 소포 세포내이입

초록

출처: Villarreal, S., et. al., 배양된 해마 뉴런에서 시냅스 소포 세포내구증 측정. J. Vis. Exp. (2017)

이 비디오는 양고추냉이 과산화효소 표지 및 전자 현미경을 통해 배양된 해마 뉴런의 시냅스 소포 세포내이입 분석을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

전자 현미경

1. HRP(양고추냉이 과산화효소)를 31.5 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 90 mM KCl, 25 mM HEPES(pH 7.4), 30 mM 포도당, 2 mM MgCl₂, 0.01 mM CNQX, 0.05 mM AP5 및 5 mg/mL HRP로 사용하여 높은 K⁺ 자극 용액을 준비한 다음 5 M NaOH로 pH 7.4로 조정합니다.
   1. 실온에서 1.5mL의 높은 K⁺ 자극 용액(K⁺라고 함)으로 해마 뉴런 배양을 각 웰에 90초 동안 1.5mL를 첨가하여 자극합니다. 휴지 상태(R이라고 함)에서 5mg/mL HRP의 동일한 농도를 90초 동안 적용하되 일반 식염수를 사용합니다. 회수 샘플의 경우 K⁺ 샘플과 마찬가지로 높은 K⁺ 자극 용액을 도포한 다음 빠르게 세척하고 일반 식염수로 교체하고 10분 동안 배양합니다.
2. 정착 및 염색
   
   1. pH 7.4에서 21.4 g / L Na cacodylate를 사용하여 0.1 M Na cacodylate buffer를 준비합니다. 실온에서 0.1M Na cacodylate buffer에 4% glutaraldehyde가 있는 세포를 1시간 이상 고정합니다. 0.1M Na 카코딜레이트 완충액으로 각각 7분씩 3회 세척합니다.
   2. 0.5mg/mL의 DAB와 0.3%_H2O2를 _ddH2O로 구성된 디아미노벤지딘(DAB) 용액을 준비하고 0.22μm 필터로 여과합니다. 1.5mL DAB 용액을 37°C에서 30분 동안 바르고 0.1M Na 카코딜레이트 버퍼로 각각 7분 동안 3회 세척합니다.
      주의: DAB는 독성이 있고 발암 물질이 의심됩니다. 장갑과 실험복을 사용하십시오.
      참고: DAB를 사용한 라벨링은 HRP에 의해 촉매 작용된 H₂O_{2 에} 의한 산화로 인해 발생합니다. 성분이 조금만 증가하면 샘플의 신호가 증가합니다. HRP의 농도를 높이면 촉매의 효과가 빨라집니다. 충분히 큰 농도의_H2O₂는 HRP와의 쇠약성 부작용을 허용하여^{표지 32}의 효과를 억제합니다. 이 연구에서는 현재 이용 가능한 연구를 기반으로 이 라벨링 시스템의 농도를 선택했습니다.
   3. 고정 후 고정 시 0.1 M Na cacodylate buffer에 1.5 mL의 1% OsO₄를 4 °C에서 1 시간 동안 배양합니다. 1.5mL의 0.1M Na 카코딜레이트 완충액으로 각각 7분 동안 3회 세척합니다.
      주의: OsO₄의 독성 및 반응성으로 인해 많은 경우 배양을 위해 냉장고를 사용하는 것보다 화학 후드의 얼음 위에 샘플을 보관하는 것이 선호됩니다.
   4. pH 5.0에서 13.61g/L 아세트산나트륨 및 11.43mL/L 빙초산으로 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼를 준비합니다. pH 5.0에서 1.5mL 0.1M 아세테이트 완충액으로 각각 7분 동안 3회 세척하고 pH 5.0에서 4°C에서 1시간 동안 0.1M 아세테이트 완충액에 1.5mL 1% 우라닐 아세테이트로 3회 세척합니다.
      
3. 에폭시 임베딩
   
   1. 50%, 70% 및 90% 에탄올을 각각 7분 동안 1.5mL 세척으로 한 번 세척한 다음 흄 후드에서 1.5mL 100% 에탄올을 각각 7분 동안 3회 세척하여 뉴런 배양을 탈수합니다.
   2. 485mL/L 비스페놀-A-(에피클로르히드린) 에폭시 수지, 160mL/L 도데세닐 숙신산 무수물(DDSA), 340mL/L 메틸-5-노보르넨-2,3-디카르복실산 무수물(NMA) 및 15mL/L 2,4,6-트리스(디메틸아미노메틸)페놀(DMP-30)을 혼합하여 에폭시 수지를 만듭니다. 철저히 혼합한 다음 진공 상태에서 보관하여 기포를 제거하십시오.
      참고: 절단 중에 수지에 충치를 유발할 수 있으므로 수지의 기포, 특히 육안으로 볼 수 있는 것보다 작은 기포를 제거하는 것이 중요합니다.
   3. 셰이커에서 실온에서 30분 동안 에탄올에 포함된 에탄올에 에탄올을 50% 에폭시 수지로 교체한 다음 셰이커에서 실온에서 30분 동안 에탄올에 70% 에폭시 수지를 교체하여 샘플을 침투시킵니다.
   4. 에폭시 수지 용액을 100% 에폭시 수지로 전환하고 50°C에서 10분 동안 배양합니다. 50°C에서 1시간 동안 신선한 100% 에폭시 수지를 배양하여 두 번 교환합니다. 신선한 100% 에폭시 수지를 추가하고 50°C에서 하룻밤 동안 경화시킨 다음 60°C에서 36시간 이상 경화시킵니다.
4. 보석상의 톱으로 muti-well 플레이트에서 각 샘플을 제거합니다. 도립 광 현미경을 사용하여 관심 영역, 조밀한 세포 농도를 선택한 다음 마이크로톰으로 절단하기 위해 70-80nm 블록을 절단합니다. 절단 부위를 마이크로톰 척에 장착하고 마이크로톰을 로드합니다. 마이크로톰에 척을 배치하고 가장자리가 블록 표면과 평행하도록 다이아몬드 나이프를 장착합니다. 70 - 80 nm 두께의 절편을 개별 그리드에 직접 수집합니다.
5. 우라닐 아세테이트를 물에 용해시켜 중량 기준 1% 용액을 만들고, 구연산납을 물에 별도로 용해시켜 중량 기준 3% 용액을 만듭니다. 1% 수성 우라닐 아세테이트를 15분 동안 침수한 다음 3% 수성 납 구연산염을 5분 동안 침수하여 단면을 대조하여 샘플의 대비를 개선합니다.
6. EM imaging
   1. 투과 전자 현미경으로 단면을 검사하고 10,000-20,000X의 기본 배율에서 CCD 디지털 카메라로 이미지를 기록합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
신경기저 배지	써모 피셔	21103-049	뉴런 성장 배지, 사용 전 37°C까지 예열
B27	써모 피셔	17504-044	뉴런 분화를 위한 그래디언트
글루타맥스	써모 피셔	신경 배양을 위한 구배
소 췌장에서 추출한 트립신 XI	시그마	T1005	신경 배양-소화 해마 조직
소 췌장에서 추출한 데옥시리보뉴클레아제 I	시그마	D5025	신경 배양 억제 점성 세포 현탁액
폴리-l-라이신	시그마	P4832	전자 현미경, 실온에서 1시간 동안 멀티웰 플레이트에 도포한 후 멸균수로 3회 세척
양고추냉이 과산화효소(HRP)	시그마	P6782	전자 현미경, 과산화수소가 존재하는 상태에서 DAB를 촉매하여 세포내이입된 시냅스 소포의 라벨링, 최종 농도는 일반 식염수에서 5mg/mL, 사용 전에 새로 만들기
카코딜산나트륨	전자 현미경 과학	12300	전자 현미경, 고정제 및 세척용 완충액, 최종 농도는 0.1 N
3,3'-디아미노벤지딘(DAB)	시그마	D8001	전자 현미경, 세포내사이토스 시냅스 소포의 라벨링, HRP용 기질, 최종 농도는 DDW에서 0.5mg/mL이고 여과, 사용 전 새로 만들기
과산화수소 용액	시그마	H1009	전자 현미경, HRP-DAB 반응을 유도하여 세포내이입 시냅스 소포 라벨링, DDW에서 최종 농도는 0.3%, 사용 전 새로 만들기
글루타르알데히드	전자 현미경 과학	16365	전자 현미경, 고정제, 최종 농도는 Na-cacodylate buffer에서 4%입니다. 사용하기 전에 새로 만들고, 사용하기 전에 잘 흔들어
TEM	JEOL	200CX	전자 현미경, 세포내구증 소포 및 초구조 변화 영상
CCD 디지털 카메라	AMT	XR-100	전자 현미경, 이미지 캡처
구연산납	라이카 마이크로시스템	16707235	전자 현미경, 그리드 염색

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