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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.
전자 현미경
- HRP(양고추냉이 과산화효소)를 31.5 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 90 mM KCl, 25 mM HEPES(pH 7.4), 30 mM 포도당, 2 mM MgCl2, 0.01 mM CNQX, 0.05 mM AP5 및 5 mg/mL HRP로 사용하여 높은 K+ 자극 용액을 준비한 다음 5 M NaOH로 pH 7.4로 조정합니다.
1. 실온에서 1.5mL의 높은 K+ 자극 용액(K+라고 함)으로 해마 뉴런 배양을 각 웰에 90초 동안 1.5mL를 첨가하여 자극합니다. 휴지 상태(R이라고 함)에서 5mg/mL HRP의 동일한 농도를 90초 동안 적용하되 일반 식염수를 사용합니다. 회수 샘플의 경우 K+ 샘플과 마찬가지로 높은 K+ 자극 용액을 도포한 다음 빠르게 세척하고 일반 식염수로 교체하고 10분 동안 배양합니다. - 정착 및 염색
- pH 7.4에서 21.4 g / L Na cacodylate를 사용하여 0.1 M Na cacodylate buffer를 준비합니다. 실온에서 0.1M Na cacodylate buffer에 4% glutaraldehyde가 있는 세포를 1시간 이상 고정합니다. 0.1M Na 카코딜레이트 완충액으로 각각 7분씩 3회 세척합니다.
- 0.5mg/mL의 DAB와 0.3%H2O2를 ddH2O로 구성된 디아미노벤지딘(DAB) 용액을 준비하고 0.22μm 필터로 여과합니다. 1.5mL DAB 용액을 37°C에서 30분 동안 바르고 0.1M Na 카코딜레이트 버퍼로 각각 7분 동안 3회 세척합니다.
주의: DAB는 독성이 있고 발암 물질이 의심됩니다. 장갑과 실험복을 사용하십시오.
참고: DAB를 사용한 라벨링은 HRP에 의해 촉매 작용된 H2O2 에 의한 산화로 인해 발생합니다. 성분이 조금만 증가하면 샘플의 신호가 증가합니다. HRP의 농도를 높이면 촉매의 효과가 빨라집니다. 충분히 큰 농도의H2O2는 HRP와의 쇠약성 부작용을 허용하여표지 32의 효과를 억제합니다. 이 연구에서는 현재 이용 가능한 연구를 기반으로 이 라벨링 시스템의 농도를 선택했습니다. - 고정 후 고정 시 0.1 M Na cacodylate buffer에 1.5 mL의 1% OsO4를 4 °C에서 1 시간 동안 배양합니다. 1.5mL의 0.1M Na 카코딜레이트 완충액으로 각각 7분 동안 3회 세척합니다.
주의: OsO4의 독성 및 반응성으로 인해 많은 경우 배양을 위해 냉장고를 사용하는 것보다 화학 후드의 얼음 위에 샘플을 보관하는 것이 선호됩니다. - pH 5.0에서 13.61g/L 아세트산나트륨 및 11.43mL/L 빙초산으로 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼를 준비합니다. pH 5.0에서 1.5mL 0.1M 아세테이트 완충액으로 각각 7분 동안 3회 세척하고 pH 5.0에서 4°C에서 1시간 동안 0.1M 아세테이트 완충액에 1.5mL 1% 우라닐 아세테이트로 3회 세척합니다.
- 에폭시 임베딩
- 50%, 70% 및 90% 에탄올을 각각 7분 동안 1.5mL 세척으로 한 번 세척한 다음 흄 후드에서 1.5mL 100% 에탄올을 각각 7분 동안 3회 세척하여 뉴런 배양을 탈수합니다.
- 485mL/L 비스페놀-A-(에피클로르히드린) 에폭시 수지, 160mL/L 도데세닐 숙신산 무수물(DDSA), 340mL/L 메틸-5-노보르넨-2,3-디카르복실산 무수물(NMA) 및 15mL/L 2,4,6-트리스(디메틸아미노메틸)페놀(DMP-30)을 혼합하여 에폭시 수지를 만듭니다. 철저히 혼합한 다음 진공 상태에서 보관하여 기포를 제거하십시오.
참고: 절단 중에 수지에 충치를 유발할 수 있으므로 수지의 기포, 특히 육안으로 볼 수 있는 것보다 작은 기포를 제거하는 것이 중요합니다. - 셰이커에서 실온에서 30분 동안 에탄올에 포함된 에탄올에 에탄올을 50% 에폭시 수지로 교체한 다음 셰이커에서 실온에서 30분 동안 에탄올에 70% 에폭시 수지를 교체하여 샘플을 침투시킵니다.
- 에폭시 수지 용액을 100% 에폭시 수지로 전환하고 50°C에서 10분 동안 배양합니다. 50°C에서 1시간 동안 신선한 100% 에폭시 수지를 배양하여 두 번 교환합니다. 신선한 100% 에폭시 수지를 추가하고 50°C에서 하룻밤 동안 경화시킨 다음 60°C에서 36시간 이상 경화시킵니다.
- 보석상의 톱으로 muti-well 플레이트에서 각 샘플을 제거합니다. 도립 광 현미경을 사용하여 관심 영역, 조밀한 세포 농도를 선택한 다음 마이크로톰으로 절단하기 위해 70-80nm 블록을 절단합니다. 절단 부위를 마이크로톰 척에 장착하고 마이크로톰을 로드합니다. 마이크로톰에 척을 배치하고 가장자리가 블록 표면과 평행하도록 다이아몬드 나이프를 장착합니다. 70 - 80 nm 두께의 절편을 개별 그리드에 직접 수집합니다.
- 우라닐 아세테이트를 물에 용해시켜 중량 기준 1% 용액을 만들고, 구연산납을 물에 별도로 용해시켜 중량 기준 3% 용액을 만듭니다. 1% 수성 우라닐 아세테이트를 15분 동안 침수한 다음 3% 수성 납 구연산염을 5분 동안 침수하여 단면을 대조하여 샘플의 대비를 개선합니다.
- EM imaging
- 투과 전자 현미경으로 단면을 검사하고 10,000-20,000X의 기본 배율에서 CCD 디지털 카메라로 이미지를 기록합니다.