형질전환 마우스의 신경염증에 대한 생물발광 이미징

초록

출처: Breid, S., et. al. alpha-synuclein fibrils의 말초 접종 후 형질전환 마우스의 신경염증에 대한 생물 발광 이미징. J. Vis. Exp. (2017)

이 비디오는 형질전환 마우스의 신경염증에 대한 생물 발광 이미징을 보여주며, 활성화된 성상세포에서 루시페라제-루시페린 반응을 보여줍니다. 이 프로토콜은 성상세포 활성화의 비침습적 정량화를 가능하게 하여 CNS 염증 및 치료 효능에 대한 연구를 지원합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

동물 모델

1. Intercross hemizygous Tg(Gfap-luc+/-) 마우스와 반접합 Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) 마우스를 생성합니다.
2. 인간 알파-시누클레인을 인코딩하는 전이유전자의 존재에 대한 Real-Time PCR과 반딧불이 루시퍼라아제에 대한 표준 PCR을 사용하여 자손을 유전자형화합니다.
3. 생후 6주에서 8주가 되면 동물에게 접종합니다.

접종물 제제

1. 20mM Tris-HCl(pH 7.2)에 150mM NaCl을 함유하는 Tris-buffered saline(TBS) 완충액에서 A53T 돌연변이를 가진 단량체 재조합 인간 알파-시누클레인을 준비합니다.
2. 5일 동안 800rpm 및 37°C의 궤도 셰이커에서 3μg/μL의 단량체 재조합 인간 알파-시누클레인을 교반하여 접종을 위해 섬유소 알파-시누클레인을 준비합니다.
3. 복강내 접종을 위해 1 μg/μL의 최종 농도에 도달하기 위해 인산염 완충 식염수(PBS)에서 피브릴 어셈블리를 희석합니다.
4. 얼음 위에서 막대 초음파 처리기로 알파-시누클레인 원섬유를 1분 동안 조각화합니다(각 펄스와 진폭 사이에 1초 동안 일시 중지, 0.5초 동안 지속). 진폭은 50%로 설정됨). 교차 파종에 의한 오염을 방지합니다. 깨끗한 초음파 처리 프로브를 사용하여 다양한 접종물을 준비하십시오.

복강내 주사

1. 복강내 주사의 경우, 2L/min의 유속으로 이소플루란/산소를 흡입하고 기화기를 2%로 설정하여 마취실에서 동물을 즉시 마취시킵니다. 동물의 발가락을 꼬집고 적절한 마취를 위해 뒷다리를 빼지 않는지 확인합니다.
2. 27G의 일회용 피하 주사기에 50μL의 초음파 처리된 알파-시누클레인 피소 또는 PBS를 채웁니다. 위치
3. 마우스의 복막에 직접 주입하고 머리가 조사자로부터 반대쪽을 향하고 약 45°에서 아래쪽을 향하도록 동물을 등쪽 자세로 잡고 복벽 뒤에 위치한 소장이나 맹장을 관통하지 않도록 합니다. 동물이 마취에서 회복될 때까지 동물을 모니터링합니다.

생물 발광 이미징

1. Image Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) 마우스는 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 2-4주마다 사용합니다.
2. 이미징하기 전에 이소플루란/산소 챔버에서 유속이 2L/min이고 기화기를 2%로 설정하여 마우스를 짧게 마취합니다. 동물의 발가락을 꼬집고 적절한 마취를 위해 뒷다리를 빼지 않는지 확인합니다.
3. 제모 크림으로 쥐의 머리를 면도하고 제모하십시오. 불특이적 생물 발광을 차단하기 위해 자극적이지 않은 마커로 귀를 검은색으로 칠합니다.
4. 루시페라아제의 기질인 D-루시페린 칼륨 염을 PBS에 30mg/mL 원액으로 희석합니다. -20 °C에서 1mL 분취액에 보관하십시오.용해된 D-루시페린이 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오.
5. 주사하기 전에 동물의 무게를 잰다. 체중 150mg/kg 주사에 대한 D-루시페린의 정확한 부피를 계산합니다. 복강내 D-루시페린을 주사하고 동물을 마취실로 되돌립니다.
6. 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 이미징 시스템이 작동 온도에 도달한 후 제어판에서 '초기화' 버튼을 클릭하여 시스템을 초기화합니다.
7. 'Luminescent' 및 'Photograph' 버튼을 선택합니다. 노출 시간을 60초로, 비닝을 '중간'으로, F/Stop을 '1'로, EM 게인을 'Off'로 설정합니다.
8. 여기 필터가 '차단'으로 설정되어 있고 방출 필터가 '개방'으로 설정되어 있는지 확인하고 피험자 높이를 1.50cm로 설정합니다.
9. D-루시페린 주사 후 10분 후 동물을 이미징 챔버의 가열판에 놓고 주둥이가 마취구에 올바르게 배치되었는지 확인합니다. 흡입실에서 이소플루란/산소 흐름을 닫고 0.25L/min의 유속과 2%의 증발로 이미징 챔버의 흐름을 엽니다. 이미징 챔버의 도어를 제대로 닫습니다.
10. 'Acquire' 버튼을 클릭하여 60초가 소요되는 생물 발광을 측정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
27-gauge syringe	VWR	613-4900
Isoflurane	Piramal Healthcare	PZN 4831850
Depilatory cream	Veet
Secureline lab marker	Neolab	25040
D-루시페린 칼륨염	Acris	LK10000	30 mg/mL 스톡 솔루션
Thermomixer	Eppendorf	5776671
Sonopuls Mini20 초음파 발생기	Bandelin	3648
IVIS Lumina II imaging system	PerkinElmer
Living Image 3.0 Software	PerkinElmer
Tg(M83+/-) 마우스 또는 B6; C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J 마우스	잭슨 연구소	4479