Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes (형광 친유성 염료를 사용한 초파리 운동 뉴런의 역행 라벨링)

초록

출처: Inal, M. A. et. al., Retrograde tracing of Drosophila Embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes(유성필 형광 염료를 사용한 {{}}초파리{{}} 배아 운동 뉴런의 역행 추적. J. Vis. Exp. (2020)

이 비디오는 친유성 염료를 사용하여 Drosophila 운동 뉴런의 역행 표지 방법을 보여줍니다. 염료는 축삭돌기로 들어가 역행적으로 이동하고 뉴런을 녹색으로 표시하여 컨포칼 현미경 하에서 뉴런의 형태와 투영을 자세히 시각화할 수 있습니다.

프로토콜

1. 장비 및 용품

1. 배아를 수집하고 성인이 알을 낳도록 훈련시키기 위한 재료
   1. 50mL 튜브를 절단하고 캡의 구멍을 잘라 100μm의 기공을 가진 메쉬 필터를 설정하여 여과 장치를 준비합니다. (재료 표) 튜브와 캡 사이.
      참고: 또는 100μm(Table of Materials)의 기공을 가진 세포 스트레이너를 배아 채취의 여과 단계에 사용할 수 있습니다.
   2. 나열된 지침에 따라 포도 한천 프리믹스(재료 표)로 한천 플레이트를 만듭니다. 간단히 분말 혼합물 한 패킷을 실온(RT, 23°C) 증류수(dH_2O) 500mL에 넣고 부드럽게 저어주고 용해된 혼합물을 전자레인지에 넣어 세게 끓입니다. 70-75 ° C로 냉각 한 후 혼합물을 페트리 접시 (60mm)에 붓습니다. 한천이 응고된 후 플레이트를 4°C에서 보관하십시오.
   3. 활성 건조 효모(Table of Materials)와 물을 페이스트 농도에 혼합하여 효모 페이스트를 준비하고 4°C에서 유지합니다.
   4. 충분한 공기 흐름을 제공하는 계란 채취 케이지(60mm 페트리 접시용, 재료 표)를 사용하십시오.
      
2. Preparation of dissection-tile<-type:decimal;'>
3. 내경이 0.6mm이고 외경이 1.2mm인 동일한 모세관 튜브에서 염료 주입 마이크로피펫 및 해부 바늘을 준비합니다(재료 목록). 마이크로피펫 풀러로 최대 출력 170V(Table of Materials)에서 7%의 속도로 모세관 튜브를 당겨 길이가 ~0.4cm인 테이퍼가 있는 날카로운 바늘을 만듭니다.
4. 염료 주입의 경우 기기 설명서에 설명된 기포 베벨링 기술에 의해 비스듬한 마이크로피펫(재료 표)으로 마이크로피펫을 조정합니다.
   1. 요컨대, 물이 바늘 끝을 '끌기'하는 것을 방지하기 위해 그라인더에 습윤제(재료 표)를 담그십시오. 마이크로피펫 cl에 바늘을 놓습니다.amp 25-30°에서 팁을 베벨링 표면 중심에서 반경의 2/3로 내립니다. 튜브가 있는 주사기가 바늘로 공기를 밀어 넣어 마이크로피펫에 유리 부스러기가 없는지 확인하는 동안 바늘을 갈아줍니다.
   2. 비스듬히 형성된 마이크로피펫의 좁은 개구부를 찾는 것이 어렵기 때문에 베벨 후 팁에서 개구부의 위치를 나타내기 위해 마이크로피펫에 미세한 팁 영구 마커를 표시합니다.

2. 배아 수집

1. 준비수컷과 암컷의 성체 파리(20-40 야생형 Canton-S 또는 흰 파리)가 이상적인 난자 수집을 위해 젊고(<7일) 건강한 상태로 유지되는지 확인합니다.
   참고: 알을 낳는 것을 자극하기 위해, 파리는 적어도 하루에 한 번 효모 페이스트가 줄무늬가 있는 한천 플레이트에서 알을 채취하기 며칠 전에 알 채취 케이지에서 훈련을 받습니다.

3. 배아 스테이징

1. 파리가 RT에서 하룻밤(또는 최소 15시간) 알을 낳도록 허용하여 알을 낳은 후 15시간(AEL), 즉 16단계에서 배아를 수집하여 전방 모서리 세포(aCC)와 생 새우 3(RP3) 운동 뉴런의 수상돌기 형성을 확인합니다. 아침에는 계란이 담긴 접시를 모으십시오.
   참고: 15시간 AEL의 배아는 뚜렷한 4개의 챔버 장을 가질 것입니다. 이미징의 경우 각 단계가 특정 형태학적 기준과 노화 조건을 따릅니다.
2. 배아를 채취하려면 접시에 낳은 난자를 50% 표백제로 5분 동안 분리하십시오.
3. 융모가 제거되면 여과 장치 또는 세포 여과기를 통해 플레이트의 내용물을 부어 배아를 분리합니다. 짜낸 물병을 사용하여 접시에 남아 있는 표백제를 희석하고 혼합물을 필터에 디캔팅하여 가능한 한 많은 배아를 모읍니다.
4. 더 많은 물로 또는 표백제 냄새가 사라질 때까지 필터의 배아를 3-4x 세척합니다. 장치에서 필터를 제거하고 배아를 물로 다른 깨끗한 플레이트에 씻습니다. 배아가 있는 새 접시에서 물을 디캔팅합니다.
5. 가는 집게를 사용하여 15시간 AEL에서 5−10개의 배아를 개별적으로 선택하고 등쪽이 위를 향하도록 양면 테이프에 놓습니다. 배아가 건조되지 않도록 보호하기 위해 곤충 Ringer's saline을 해부 풀에 추가합니다(그림 1).

4. 해부 및 염색

1. 해부 현미경 (Table of Materials) 아래에서 유리 바늘을 사용하여 단일 배아의 표면에서 뒤쪽에서 앞쪽 끝까지 정중선을 절단합니다. 그런 다음 테이프의 vitelline 멤브레인에서 배아를 유리로 드래그합니다(그림 1 상자에 넣음). 배아의 내부 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.
2. 중앙에서 상피 조직을 뒤집고 표피 가장자리를 유리 슬라이드 표면에 부착합니다(그림 1, 삽입 사진).
3. 끝 구멍이 ~300μm인 튜브 연결 바늘(해부 바늘의 얇은 끝을 부러뜨려 준비)을 사용하여 흡인하거나 공기를 불어넣어 등쪽 세로 기관 몸통과 남아 있는 내장을 분리하고 제거합니다.
4. 인산염 완충 식염수(PBS)에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 RT에서 5분 동안 배아를 고정합니다. PBS로 배아를 3번 세척합니다.
시아닌 3 염료(anti-HRP Cy3)와 접합된 1μL의 항 고추냉이 과산화효소 항체로 배아를 200μL의 PBS에서 1시간 동안 염색합니다. 염색 후 PBS로 배아를 3번 세척합니다.
5. 
   참고: 반대로 HRP의 염료는 주입을 위해 선택되는 친유성 염료에 기초를 두어 바뀔 수 있습니다.

5. 주입 마이크로 피펫 채우기

1. 친유성 염료 가열(3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine, perchlorate(DiO) 또는 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt(DiD)의 5mg/mL, 재료 표) 사용하기 전에 에탄올:식물성 기름을 1:10 혼합물로 60°C까지
가열합니다.
2. 주입 마이크로피펫용 오일에 용해된 염료 슬라이드를 준비합니다. 마이크로피펫을 모세관 홀더에 넣습니다(그림 2, #1). micromanipulator(Table of Materials)를 사용하여 마이크로피펫이 염료 슬라이드 위에 오도록 조정합니다. 그런 다음 스테이지를 조정하여 마이크로피펫을 염료 위에 놓습니다(그림 2, #2).
3. 마이크로피펫을 채우려면 마이크로인젝터(재료 표)를 사용하십시오(그림 2, #3). P_i (주입 압력)를 200-500 hPa (헥토 파스칼) 사이, T_i (주입 시간)를 0.1-0.5 초 사이 및 P_c (보상 압력)를 5 분 동안 0 hPa로 설정하여 마이크로 피펫에 염료를 수집합니다 (그림 2, # 4).
4. 염료가 수집되면 염료 슬라이드를 제거하고 샘플을 현미경 스테이지에 놓습니다. 다음으로, 모세관 작용에 의한 PBS의 오염을 방지하기 위해 마이크로피펫을 샘플로 내리기 전에 Pc를 20-60hPa 범위로 높입니다.

6. 뉴런

1. 에 염료 주입10x 대물렌즈(Table of Materials)가 있는 현미경을 사용하여 배아를 중앙에 배치하고 마이크로피펫을 배아와 정렬합니다.
   참고: 염료 방울의 크기는 Pi 또는 마이크로피펫 팁의 개구부 크기를 변경하여 조정할 수 있습니다. 액적은 10-20μm여야 하며, 이는 대략 근육 1개의 너비입니다.
2. 대물 렌즈를 물에 담글 수 있는 40x 렌즈(재료 표)로 변경하고 렌즈를 PBS에 담궈 배아를 봅니다.
   <
   1. span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>형광 현미경을 사용하여 anti-HRP Cy3로 표시된 신경 형태를 확인하고 주입 부위를 결정합니다.
   2. 주입하는 동안 명시야 현미경을 사용하여 염료 방울을 확인합니다. 배아에 초점이 맞춰지면 마이크로피펫의 위치를 변경하여 관심 축삭의 끝(예: aCC, RP3)과 부드럽게 접촉합니다.
   3. anti-HRP Cy3로 표시된 뉴런을 사용하여 DiD 또는 DiO와 aCC 또는 RP3(그림 3)의 신경근 접합부에서 오른쪽 복부(A2-A6) 반분절에 염료를 떨어뜨립니다. 손 컨트롤(마우스; 그림 2, 5)는 마이크로매니퓰레이터로 염료를 떨어뜨린 후 염료를 방출하고 마이크로피펫을 제거하고 다음 주입 부위로 이동합니다.
      참고: 간극연접을 통해 이웃 세포로 퍼지는 다른 염료(예: Lucifer yellow, calcein)와 달리 친유성 염료는 세포막과 결합하고 이웃으로 전달되지 않습니다. 그러나 염료 방울의 크기가 상대적으로 크기 때문에 이 기술은 파트너 근육의 표지를 초래합니다(그림 3A).
3. 이미징 전에 염료 낙하 후 1시간 동안 RT에서 샘플을 배양합니다.
   참고: 프로토콜은 장착하기 전에 여기에서 일시 중지할 수 있으며 샘플은 밤새 4°C에서 보관할 수 있습니다. Lipophilic 염료는 세포 내 직접 결합(DC) 증폭기를 쉽게 사용할 수 있는 경우 iontophoresis를 사용하여 전달할 수도 있습니다.

7. 컨포칼 현미경

1. 으로 이미징집게를 사용하여 유리 슬라이드에서 양면 테이프와 비닐 테이프를 제거합니다.
2. 네 모서리에 소량의 진공 그리스(Table of Materials)를 묻힌 커버 슬립(22 x 22 mm2 No.1 커버 유리)을 준비하고 기포를 피하면서 샘플에 조심스럽게 놓습니다. 작업 와이퍼를 사용하여 여분의 PBS를 제거합니다.
3. 커버슬립을 아래로 눌러 대물 렌즈와 샘플 사이의 작동 거리를 조정합니다. 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 완전히 밀봉하십시오.
4. 이미지.

결과

그림 1: 해부 풀 설정. 유리 슬라이드에 보이는 파란색 챔버는 내부에 버퍼를 고정하는 비닐 테이프로 만들어졌습니다. 양면 테이프는 적절하게 정렬된 배아를 고정합니다. 또한 왼쪽 하단 모서리에는 식염수에서 절개된 배아의 예가 표시됩니다. 앞쪽 끝은 이 그림과 모든 후속 그림에서 맨 위에 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10x objective lens	니콘		Plan
40x 침수 렌즈	Nikon		NIR Apo
Capillary tubing	Frederick Haer&Co	27-31-1
컨포칼 현미경	Andor	N/A	잠자리 스피닝 디스크 컨포칼 유닛
커버 유리	Corning		22x22 mm 정사각형 #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888	<
ThermoFisher	V22887
Dissecting microscope	Nikon	N/A	SMZ-U
양면 tape	Scotch	665
Dow corning 고진공 그리스	피셔 과학.	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Egg collection cage	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	discontinued	FemtoJet 4i (고양이 번호 5252000021)
Micromanipulator	Sutter	MP-225
마이크로 피펫 beveler	Sutter	BV-10-B
바늘 풀러	Narishige	PC-100
Nutri-fly 포도 한천 가루 프리믹스 패킷	FlyStuff	47-102
나일론 그물 filter	Millipore
파라포름알데히드 16% 용액, EM grade	전자 현미경 과학	15710	모든 EM grades
PBS	Roche	11666789001	sigmaaldrich에서 판매, 박스형 10x 솔루션
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	습윤제
직립 형광 현미경	Nikon	N/A	LED 광원
비닐 전기 테이프	Scotch	6143
VWR 셀 스트레이너	VWR	10199-659<
Yeast	FlyStuff	62-103	활성 건조 효모(RED STAR)

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