말초 혈액 유래 세포와 분화된 신경 세포의 면역형광 현미경 검사

초록

출처: Becker-Kojić, Z. A., et. al., 혈액 유래 신경 세포의 GM 프리 생성. J. Vis. Exp. (2021)

이 비디오는 형광 현미경 검사를 위해 재프로그래밍된 말초 혈액 세포에서 유래한 신경 세포를 준비하는 프로토콜을 보여주며, 면역 형광 이미징을 통해 뚜렷한 세포 유형과 발달 단계를 보여줍니다.

프로토콜

1. 혈액 유래 신경 세포의 면역형광 현미경 분석
   1. 세포를 16일 동안 배양하고 배지를 제거합니다.
      1. 75mL의 멸균수, 4g의 파라포름알데히드로 구성된 예열된 고정제로 배양합니다. 필요에 따라 10N NaOH를 추가하고 용액이 제거될 때까지 저어줍니다. 그런 다음 10x PBS 10mL, MgCl₂ 0.5mL, 0.5M EGTA 2mL 및 자당 4g을 추가합니다. 6N HCl을 사용하여 pH 7.4로 적정하고 100mL의 멸균수를 15분 동안 가져옵니다.
      2. 고정제를 버리고 매번 5분씩 세포를 3회 세척합니다. 즉시 새로 만든 0.3% Triton X-solution을 추가하고 5분 동안 세포를 투과시킵니다. PBS로 3회 세척하고 PBS와 5% BSA로 만든 차단 용액을 첨가합니다.
      3. 로커 플레이트에서 실온에서 1시간 동안 셀을 차단합니다.
      4. 1% BSA/PBS에서 항체를 적절하게 희석하고 항체 희석액과 함께 세포를 실온에서 1.5시간 동안 로커 플레이트에서 배양합니다. PBS로 세포를 각각 5분씩 3회 세척하고, DAPI로 세포를 배양하고, 현미경에서 시각화할 수 있도록 장착 매체로 커버슬립을 장착합니다.
         참고: 이 실험에 사용된 직접 표지된 항체는 재료 표에 나열되어 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
안티 MAP2 알렉사 플루어 555	Merck Millipore	MAB3418A5
anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
anti-tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS 멸균	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML