Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 조직 절편의 아밀로이드 구조 분석

초록

출처: Nyström, S., et al., 초분광 컨포칼 현미경 및 형광 수명 이미징에 의한 발광 복합 올리고티오펜으로 염색된 아밀로이드 조직 이미징. J. Vis. 특급 (2017).

이 동영상은 hFTAA 염료를 사용하여 아밀로이드 조직을 반영하는 색상으로 구분된 이미지에서 소형 코어를 파란색/녹색으로, 불안정한 주변부를 빨간색/노란색으로 표시하여 형광 수명 이미징 현미경 또는 FLIM으로 아밀로이드 구조를 분석하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 조직 샘플의 준비

참고: heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA)를 아밀로이드 마커로 사용하여 많은 조직 유형을 이미지화할 수 있습니다. hFTAA는 응집체 형태에 민감합니다. 따라서 염색은 항원결정기에 노출되지 않은 중단되지 않은 응집체에서 수행되는 것이 바람직합니다. 최적의 스펙트럼 품질은 조직 고정이 최소로 유지되는 경우 달성됩니다. 따라서 염색 시 에탄올에 부드럽게 고정된 신선한 냉동 재료가 선호됩니다. 그러나 , 예를 들어 , 포르말린으로 고정된 조직에서도 아밀로이드 침착을 검출할 수 있습니다. hFTAA는 일반적으로 조직을 잘 관통합니다. 의도한 이미징 기술과 호환되는 표본 두께를 선택합니다.

1. 포르말린이 고정되고 파라핀이 함유된 절편을 사용하는 경우, 밤새 자일렌에서 파라핀을 제거해야 합니다. 그런 다음 99% 에탄올, 70% 에탄올, dH₂O 및 인산염 완충 식염수(PBS)의 연속 수조에 각각 10분씩 섹션을 담그십시오. 주변 조건에서 조직 절편이 건조되도록 합니다.
   주의: 자일렌은 항상 화학 흄 후드에서 취급됩니다. 크실렌 및 기타 유기 용제는 유해합니다.
   1. 실온에서 극저온 절편을 해동합니다. 조직 절편을 10% 포르말린으로 하룻밤 동안 고정하고 99% 에탄올, 70% 에탄올, dH₂O 및 PBS의 연속 욕조에 각각 10분씩 담궈 수분을 보충합니다. 주변 조건에서 조직 절편이 건조되도록 합니다.
2. hFTAA 작업 용액(약 200μL)의 방울을 조직 절편에 추가하여 덮습니다. 액적은 표면 장력에 의해 제자리에 유지되어야 합니다. 염색을 위해 실온에서 30분 동안 배양합니다.
3. 피펫을 사용하여 500μL PBS로 염색 용액을 헹구고 슬라이드를 PBS 수조에 10분 동안 담그십시오. 주변 조건에서 섹션을 건조시키십시오.
4. 형광 장착 매체를 사용하여 장착합니다. 장착 매체가 밤새 정착되도록 합니다.

2. FLIM
참고: 컨포칼 현미경에는 형광 수명 이미징 현미경(FLIM) 장치가 장착되어 있습니다.

1. 컨포칼 현미경에 대해 다음 매개변수를 설정합니다: 핀홀, 20; 여기 파장, 490nm; 레이저 강도, 0.5%(평균 출력 7.5μW에 해당). 40MHz에서 펄스 레이저를 사용합니다.

2. FLIM 소프트웨어에서 550nm 이상의 광자 카운팅을 설정합니다. Display parameters 창에서 Max count가 약 4,000 photon count가 될 때까지 Photon Count를 따릅니다.

위치

3. 파일을 저장하고 SPC(Single-Photon Counting) 이미지로 내보냅니다.

4. FLIM 소프트웨어에서 2성분 지수 감쇠에 데이터를 맞춥니다. χ² < 2를 제공하는 핏이 좋습니다. y축의 값은 지정된 수명에 대한 카운트 수입니다.

5. (예: ), 100을 포함할 개수의 임계값을 선택합니다. T1의 색상 코드를 선택하고 수명 범위를 선택합니다. 붕괴는 hFTAA가 결합되어 있는 아밀로이드 구조에 따라 달라집니다. 300ps에서 1,000ps 사이의 형광 수명이 관찰되었습니다. 파일을 저장합니다.

6. 내보내기 옵션을 사용하여 원시 데이터를 내보내고 원하는 데이터를 새 폴더에 저장합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech
Dako 형광 장착 매체	Agilent technologies	GM304
LeicaDM6000	Leica
Lumen 200	Prior
Spectraview system	ASI spectral imaging		<
ASI spectral imaging
LSM780	Zeiss
Zen 2010b v6.0 소프트웨어	Zeiss
FLIM 시스템	Becker & Hickl
ar/ml 458/488/514	Zeiss
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