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1.Live 이미지 기록
- 라이브 이미징을 위한 세포 준비
1. 6-웰 플레이트에 폴리-D-라이신으로 사전 코팅된 #1.5(또는 0.17mm 두께) 유리 커버슬립에 녹색 형광 단백질 표지 포도당 수송체 4(GFP-GLUT4)를 발현하는 WT 및 CCR5-/- 시상하부 뉴런 세포를 배양합니다.
2. 집게를 사용하여 뉴런이 있는 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 유리 슬라이드에 조심스럽게 올려 놓습니다.
3. 섬세한 작업용 물티슈로 여분의 매체/액체를 제거합니다. 물티슈를 두 번 접고 커버 슬립 위에 조심스럽게 놓습니다. 커버슬립을 움직이지 않고 물티슈를 부드럽게 누릅니다.
주의: 커버 슬립을 유리 슬라이드에 세게 누르지 마십시오. 이 단계의 목적은 부력으로 인한 이미지 획득 중에 커버슬립이 이동/드리프트되지 않도록 하는 것입니다.
4. 디콘볼루션 현미경 스테이지에 커버슬립과 슬라이드를 커버슬립이 아래를 향하도록 하고 적절하게 고정합니다. 이 단계는 사용자가 나중에 동일한 대상 셀 세트를 추적할 수 있도록 슬라이드 위치가 일정하게 유지되도록 하는 것입니다.
5. 60x/1.42 NA 오일 이멀젼 대물 렌즈로 WT 및 CCR5-/- 시상하부 뉴런 세포를 관찰합니다.
6. 선택한 세포 샘플을 CCL5(10ng/mL) 또는 인슐린(10U/mL)으로 1분 동안 처리합니다.커버슬립 가장자리에 희석된 인슐린 1.5μL를 추가합니다.
7. 선택한 세포 샘플을 즉시 시각화하고 기록합니다. 비디오 녹화 소프트웨어를 30분 동안 녹화하도록 프로그래밍합니다.
2. 디콘볼루션 현미경 및 분석
참고: 프로토콜의 이 부분에서는 분석을 위해 디콘볼루션 현미경과 특수 소프트웨어를 사용해야 합니다.
1. 이미징 시스템의 전원을 켜고 현미경 스테이지가 제대로 초기화되도록 한 다음 LED 광원을 켭니다.
2. 60x 1.42 NA 대물 렌즈에 이멀젼 오일(37°C에서 라이브 샘플의 경우 굴절률 1.520)을 추가합니다. s를 놓습니다.amp커버 슬립이 대물 렌즈 쪽을 향하도록 현미경에 슬라이드를 놓고 슬라이드를 적절하게 고정합니다. 위치
3. 명시야 또는 형광 조명을 사용하여 표적 세포를 식별합니다. 대상 세포가 명확하게 관찰될 때까지 초점을 조정합니다. 불필요한 긁힌 자국을 피하기 위해 대물 렌즈를 커버슬립 영역 밖으로 이동하지 마십시오.
4. GFP 신호로 녹색 형광 단백질 복합 포도당 수송체 4(GFP-GLUT4)를 식별합니다. 이미지 획득을 위해 원하는 표적 세포를 식별합니다. 선택한 대상 셀 위치를 기억하여 나중에 참조할 수 있습니다(그림 1 참조).
5. 각 타겟 세포에 적절한 실험 매개변수(픽셀 수, 여기 파장, 투과 비율, 노출 시간, 스택 두께, 시간 간격 및 총 이미징 시간 포함)를 설정합니다. 이 실험을 위해 GFP 신호에 대해 이미지 픽셀 번호를 512 x 512(더 높은 해상도를 위해 1,024 x 1,024로 설정할 수 있음)로 설정했습니다. 노출 시간은 5분마다 0.025초에서 0.05초 사이로 설정되었습니다. 사소한 측면 x, y 및 z 조정은 권장 소프트웨어로 제어할 수 있습니다(재료 표 참조).
6. 최대 픽셀 강도를 얻기 위해 노출 매개변수를 약 2,000에서 3,000 카운트로 설정합니다. 형광 광표백을 최소화하려면 노출 시간을 1초 미만으로 유지하면서 여기광 투과율을 최대한 줄이십시오. 각 추가 형광 채널과 각 개별 관심 영역에 대해 이 단계를 반복합니다.
7. 각 대상 셀에서 Z 스택의 상한과 하한을 설정합니다. 이는 표적 세포의 상단과 하단이 모두 약간 초점에서 벗어날 때까지 현미경 스테이지를 이동하여 달성할 수 있습니다. 사용자는 상한 및 하한 사이의 이미지 수를 설정하여 Z축의 해상도를 조정할 수 있습니다(각 이미지 사이의 거리를 설정하여 수행할 수 있음).
8. 이미지 스택은 디컨볼루션되고 나중에 해당 소프트웨어(이 경우 PerkinElmer의 Velocity)의 도움으로 분석되었습니다.
