면역형광을 이용한 마우스 해마 절편의 시냅스 현미경 분석

Abstract

출처: McLeod, F., et al. 해마 설치류 뇌 절편의 시냅스 밀도 평가. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 컨포칼 면역형광 분석을 사용하여 해마 뇌 절편에서 시냅스 마커를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 슬라이스는 시냅스전 및 시냅스후 마커를 표적으로 하는 1차 항체로 면역 염색된 후 형광단 접합 2차 항체로 면역 염색됩니다. 그런 다음 표지된 마커는 공초점 현미경을 사용하여 시각화하여 공동 국소화를 통해 시냅스 구조를 평가합니다.

Protocol

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 급성 해마 슬라이스 준비

1. 주걱과 날카로운 가위를 사용하여 두개골을 자르고 얼음처럼 차갑고 산소가 공급되는 (95% O₂, 5% CO₂), 고자당 인공 뇌척수액(ACSF, ~100mL)에 넣습니다.
2. 쥐의 뇌를 페트리 접시에 올려 놓고 뇌의 정중선을 헤미싱하기 전에 메스로 소뇌와 전두엽 피질의 작은 부분을 제거합니다.
3. 방금 자른 쪽에 두 개의 반구를 놓고 각 반구를 비브라톰 무대에 붙입니다.
4. 전체 관심 영역의 200 - 300μm 두께 섹션을 자릅니다. 해마의 경우, 반구당 약 3 - 4개의 절편을 얻어야 합니다.
5. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 산소(95% O₂, 5% CO₂) ACSF에 잠긴 챔버로 슬라이스를 옮깁니다. 34°C에서 30분 동안 유지합니다.
   참고: 이 단계에서 절편은 절편 챔버에 제제를 첨가하여 재조합 Dickkopf-1(Dkk1) 단백질과 같은 활성 약리제로 치료할 수 있습니다.
6. 붓을 사용하여 챔버에서 조각을 제거하고 24웰 플레이트에 넣고 실온(RT)에서 4% 파라포름알데히드(PFA)/4% 자당에 20분에서 1시간 동안 고정합니다.
   주의: PFA는 독성이 있으므로 적절한 보호 장비를 착용하십시오.
7. 1X 인산염 완충 식염수(PBS, 각 10분)로 슬라이스를 세 번 씻습니다.
   참고: 슬라이스가 1X PBS에서 4°C로 유지되는 한 프로토콜은 1 - 2일 동안 일시 중지할 수 있습니다.

2. 시냅스 마커에 대한 면역

형광

참고: 사용된 모든 버퍼의 레시피는 표 1에서 찾을 수 있습니다.

1. 슬라이스 웰에서 PBS를 차단/투과 버퍼(표 1)로 교체하고 4 - 6시간 동안 RT에서 배양합니다.
2. 차단/투과화 완충액에서 1:2,000 희석으로 소포성 글루타메이트 수송체 1(vGlut1)에 대한 다클론 기니피그 항체를 희석합니다.
   참고: vGlut1은 시냅스 전 흥분 말단 시각화를 위한 마커입니다. 시냅스후 흥분성 시냅스 식별을 위해 시냅스후 밀도-95(PSD-95)에 대한 다클론 항체를 사용하고 동일한 용액에서 1:500으로 희석합니다. 각 웰에 최소 300μL의 부피를 사용하십시오. 해마의 해부학적 위치를 확인하려면 미세소관 관련 단백질 2(MAP2) 또는 세뇨관과 같은 신경 구조를 식별할 수 있는 항체를 사용하십시오. 선택한 시냅스 마커(시냅스 전후 및 시냅스 이후)에 대한 모든 기본 항체의 정확한 농도를 계산하고 새로운 차단/투과 완충액에서 희석합니다.
3. 4°C에서 하룻밤동안(또는 1-2일 동안) 1차 항체 용액의 슬라이스를 배양합니다. 격렬한 움직임으로 흔들리는 플랫폼을 사용하십시오.
4. PBS에서 슬라이스를 세 번 씻습니다(각 10분).
5. 차단 버퍼에 적절한 2차 항체를 1:500으로 희석합니다. 예를 들어, vGlut1 기니피그 항체를 사용할 때, 특정 형광단에 접합된 기니피그 성분(예: 당나귀 항기니피그)을 인식하는 2차 항체를 적용합니다. PSD-95 rabbit 항체를 사용할 때, 다른 특이적 형광단에 접합된 rabbit 성분(예: donkey anti-rabbit)을 인식하는 2차 항체를 적용하십시오.
6. RT에서 2 - 3시간 동안 이 용액의 슬라이스를 배양합니다. 2차 항체는 빛에 민감하므로 슬라이스가 빛으로부터 보호되는지 확인하십시오.
7. PBS에서 슬라이스를 세 번 씻습니다(각 10분).
8. 붓을 사용하여 24웰 플레이트에서 조각을 조심스럽게 제거하고 미리 레이블이 지정된 유리 슬라이드에 고르게 놓습니다. 각 슬라이스 위에 장착 매체 한 방울을 추가한 다음 슬라이스 위에 유리 커버슬립을 부드럽게 놓습니다. 기포의 형성을 피하십시오. 충분한 양이 부족하면 슬라이스가 건조해질 수 있으므로 충분한 장착 매체(300-400 μL)를 사용하도록 주의하십시오.
9. RT에서 최소 1-2일 동안 건조시키고 슬라이드를 빛으로부터 보호하십시오.
10. 슬라이드는 단기적으로 4°C에서 보관하지만 장기 보관을 위해서는 -20°C에서 보관하십시오.

3. 컨포칼 이미지 획득 및 분석

1. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용한 이미징.
   1. 이미지화할 해마 영역을 식별합니다(예: cornu ammonis 1 및 3 (CA1, CA3) 또는 dentate gyrus (DG))를 10x 또는 20x 대물렌즈를 사용합니다.
   2. 40x 또는 63x 오일 침지 대물렌즈로 변경하여 연속적인 신경돌기와 조직화된 구조를 식별하여 슬라이스 해부학이 손상되지 않았는지 확인합니다. MAP2와 같은 뉴런 마커를 참조로 사용합니다(그림 1A).
   3. 그런 다음 60x 오일 이멀젼 대물렌즈(개구수[NA] = ~1.3 - 1.4)로 전환하고 각 채널의 설정을 조정하여 최적의 신호와 대비를 얻습니다. 고대비/저대비 옵션을 사용하여 각 레이저의 강도를 설정하여 픽셀의 채도를 방지합니다.
      참고: 이 설정은 사용된 현미경에 따라 다르지만 레이저 출력 설정은 재료 표를 참조하십시오. 최상의 결과를 얻으려면 1024 x 1024 픽셀 해상도를 사용합니다. 설정은 동일한 실험의 다양한 조건에서 일정하게 유지되어야 합니다. 필요한 경우 추가 확대/축소를 적용할 수 있습니다.
   4. 염색이 균일한 깊이를 평가하고 최소 8개의 등거리(250nm) 평면의 이미지 스택을 획득합니다. 그런 다음 슬라이스당 동일한 관심 영역에서 인접한 3개의 대표 이미지 스택을 가져옵니다.
      참고: 깊이는 슬라이스마다 다를 수 있지만 항상 슬라이스 표면에서 약 2 - 5μm 떨어져 있어야 합니다.
   5. 조건당 최소 3조각, 치료 그룹당 6-8마리의 동물에서 획득을 반복합니다.

표 1: 면역형광 염색에 사용되는 버퍼.

KH₂PO₄

Blocking/pereabilizing Buffer	농도	Notes
당나귀 세럼	10%
Triton-X	0.50%
PBS	1x
10x PBS		pH to 7.4
NaCl	1.37 M
KCl	27 mM
NaH2PO4	100 mM
18 mM		4% PFA/4% Sucrose		pH to 7.4
PBS	1x	Dilute from 10x
PFA	1.33 M
Sucrose	117 mM

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Results

표 1: 면역형광 염색에 사용되는 버퍼.

Blocking/pereabilizing Buffer

Materials