1. 유기형 슬라이스 준비
참고: 이 레시피는 출생 후 7-9일(p7-9)에 두 마리의 새끼 쥐를 사용하여 24개의 유기형 슬라이스를 두 개의 6웰 배양 접시로 나눕니다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 절차는 멸균 후드에서 수행해야 하며 니트릴 또는 라텍스 장갑을 사용해야 합니다. 세포 배양 등급의 성분만 사용해야 합니다.
- 오토클레이브 병, 해부 도구(대형 가위 1개, 작은 가위 1개, 대형 납작한 주걱 1개, 둥글고 날카로운 작은 주걱 1개, 집게 1개, 자세한 내용은 재료 목록 참조), 유리 피펫, 피펫 팁 및 티슈 물티슈가 슬라이스 준비에 사용되었습니다.
- 유리 피펫의 절반은 큰 개구부와 함께 사용해야하므로 좁은 끝을 잘라냅니다.
- 다이아몬드 스크라이버 펜(사용 가능한 경우)으로 유리가 좁아지기 시작하는 지점 바로 아래에 있는 피펫 주위에 점수를 매깁니다. 그런 다음 피펫의 뾰족한 끝을 니트릴 장갑 또는 이와 유사한 것에 넣습니다. 작업대에 밀어 넣으면서 피펫을 구부려 팁을 조심스럽게 끊습니다.
- 그런 다음 부러진 끝을 사포 조각에 문질러 무디게 만들거나 분젠 버너에서 약간 녹입니다. 부러진 피펫은 절단된 뇌 절편을 옮기는 데 사용되며, 부러진 쪽 끝은 고무 전구로 바뀌고 큰 열린 쪽 끝은 용액/절편에 닿습니다.
참고: 이것은 멸균 후드에서 수행되지 않으며 며칠 전에 수행할 수 있습니다.
- 배양 요리를 준비합니다.
참고: 이것은 자르기 전날 또는 자르기 최소 2시간 전에 수행할 수 있습니다. - 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인("색종이 조각")을 살균합니다. 두 개의 멸균 집게를 사용하여 주변의 파란색 플라스틱 조각에서 색종이 조각 하나를 제거합니다. 그런 다음 96% 에탄올(EtOH)이 함유된 페트리 접시에 두 번 담그어 살균합니다. 그런 다음 멸균된 큰 페트리 접시에 색종이 조각을 평평하게 놓고 말리십시오.
참고: 색종이 조각은 배양 삽입물의 막과 유사한 친수성 PTFE 막입니다. 색종이를 사용하면 집게로 색종이를 들어 올려 삽입물에서 현미경 설정으로 단일 조각을 쉽게 전송할 수 있기 때문에 라이브 이미징에 도움이 됩니다(자세한 내용은 4.8. 참조). 또는 색종이 조각 없이 뇌 절편을 배양할 수 있습니다(이 색종이 조각은 배양 삽입물의 막에 직접 부착됩니다). 이 경우 멤브레인 삽입물을 메스로 절단하여 슬라이스를 현미경 수조로 옮겨야 합니다. - 6웰 배양 접시의 각 웰에 1mL의 배양 배지를 추가합니다.
- 멸균 집게를 사용하여 각 웰에 하나의 배양 삽입물을 놓습니다. 인서트와 배양 배지 사이에 기포가 생기지 않도록 하십시오.
참고: 비용과 환경을 절약하기 위해 배양 인서트를 재사용할 수 있습니다. 이는 증류수(dH2O)로 철저히 헹군 다음 재사용할 때까지 최소 24시간 동안 70% EtOH에서 배양하여 수행할 수 있습니다. 새로운 배양을 준비할 때 세포 배양 플레이트의 삽입물을 자외선(UV) 아래에서 15-30분 동안 건조시킵니다. - 각 배양 삽입물에 두 개의 (멸균 및 건조) 색종이 조각을 놓습니다. 겹침을 최소화하기 위해 색종이 조각을 인서트의 가장자리 쪽으로 놓습니다.
- 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 37°C에서 5% CO2로 넣습니다.
- 중산화물 가스(95% O2/5%CO2)를 사용한 기포 냉 해부 매체. 용액을 멸균 상태로 유지하려면 가스 실린더의 튜브를 멸균 주사기 필터(0.22μm 공극 크기)에 연결합니다.
- 주사기 필터의 다른 쪽 끝을 멸균 유리 피펫에 연결된 멸균 튜브에 연결합니다. 유리 피펫을 용액에 넣고 파라 필름으로 덮은 다음 가스를 켭니다. 해부 매체를 얼음 위에 보관하십시오.
- 해부/슬라이싱 영역을 준비합니다.
참고: 이상적으로 이 절차는 멸균 후드에서 수행되어야 합니다. 이것이 가능하지 않은 경우 비브라톰을 작업대에 그대로 둘 수 있습니다. 이 경우 헤어 네트와 페이스 마스크를 사용하는 것이 좋습니다. - 단면 면도날을 사용하여 직사각형 조각(약 2cm x 0.5cm)의 아가로스 젤을 잘라 비브라톰 스테이지에 붙여서 긴 면이 비브라톰 블레이드를 향하도록 합니다.
- 모든 표면과 비브라톰 부분을 70% EtOH로 청소하고 오토클레이브 티슈로 닦습니다.
참고: EtOH는 세포를 손상시킬 수 있으므로 뇌 조직과 접촉할 모든 조각이 완전히 건조되어야 합니다. - 멸균 면도날을 비브라톰에 부착하고 진동 점검을 수행하여 비브라톰에 이 기능이 있는지 확인합니다.
- 고압 증기멸균 해부 도구, 고압 멸균 티슈, 작은 페트리 접시 4개, 둥근 가장자리 메스, 고무 전구가 있는 유리 피펫 2개, 개방형 유리 피펫 2개(pt. 1.1 참조) 및 후드에 슈퍼 글루(EtOH 스프레이)를 놓습니다.
- 거품이 일어난 해부 매체를 비브라톰 보트와 4개의 작은 페트리 접시에 붓습니다.
참고: 이 단계는 이 시점부터 매체가 거품을 일으키거나 얼음 위에 보관되지 않기 때문에 해부 직전에만 수행해야 합니다.
- 뇌를 해부하고 장착합니다.
참고: 건강한 슬라이스를 얻으려면 이 단계를 빠르고 정확하게 수행해야 합니다. 약간의 연습이 필요합니다. - 동물 #1을 목을 탈구하거나 현지 지침에 따라 안락사시킨 다음 큰 가위로 목을 베십시오.
- 작고 날카로운 가위를 사용하여 목에서 코까지 시상 절개를 만들어 피부를 빠르게 제거하고 옆으로 당겨 두개골을 드러냅니다.
- 시상 봉합사를 따라 절단한 다음 전두골의 내부 부분과 람보이드 봉합사(대뇌와 소뇌 사이의 경계)를 측면 절개합니다.
- 집게를 사용하여 양쪽의 두개골을 구부려 엽니다. 뇌신경은 뇌의 복부 아래에 둥글고 날카로운 주걱을 삽입하고 주걱을 부드럽게 옆으로 움직여 뇌에서 차단합니다.
- 외날 면도날을 사용하여 소뇌의 관상 봉을 만듭니다.
참고: 이 절단은 조각이 절단되는 각도를 결정합니다. 따라서 직선 각도로 만들어야합니다. - 두개골에서 뇌를 뒤집어 해부 매체가 들어 있는 작은 페트리 접시에 넣습니다.
- 1.6.1단계를 반복합니다. - 1.6.4. 동물 #2를 위해 이 뇌를 두 번째 페트리 접시에 넣습니다.
참고: 동물들은 불임이 아닙니다. 후드의 한쪽에서 해부를 수행한 다음 두개골에서 뇌를 제거한 후 다른 쪽의 깨끗한 쪽으로 이동합니다. - 장갑을 교체하십시오.
- 비브라톰 스테이지에 뇌 부착: 장착된 아가로스 젤 바로 앞의 스테이지에 슈퍼 글루를 얇게 추가합니다. 갓 자른 (꼬리) 쪽이 주걱에 닿고 복부 쪽이 아가로스 젤을 향하고 (가능한 한 가까이 있도록) 크고 편평한 주걱으로 뇌 # 1을 잡습니다.
- 그런 다음 집게 세트로 주걱에서 뇌를 밀어 접착제 위에 부드럽게 놓습니다. 두뇌를 위한 충분한 공간을 남겨두세요 #2.
참고: 뇌가 무대에 잘 붙어 있어야 하지만 절단을 방해할 수 있으므로 과도한 접착제가 없어야 합니다.
- 뇌 #1을 장착한 직후, 큰 주걱을 사용하여 뇌 위에 해부 매체를 몇 방울 떨어뜨립니다. 이렇게 하면 뇌가 촉촉하게 유지되고, 접착제가 굳어지며, 뇌 측면에 달라붙는 것을 방지할 수 있다.
- 1.6.7 및 1.6.8단계를 반복합니다. 뇌를 위해 #2.
- 스테이지를 비브라톰 보트에 부착합니다.
- 진폭이 1 - 1.5 mm, 주파수가 85 Hz, 속도가 0.2 mm/s인 230 μm 두께의 코로나 슬라이스를 절단합니다. 브레그마에서 대략 1.4mm의 꼬리 부분과 2.1mm 사이의 조각을 수집합니다.
- 개방형 유리 피펫을 사용하여 각 슬라이스를 자른 후 슬라이스를 수집합니다(pt. 1.1). 슬라이스를 해부 매체가 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 둥근 메스를 사용하여 조각을 두 조각으로 자르고 두 반구를 나눕니다.
- 모든 조각이 잘리면 조각을 배양 접시에 넣습니다.
- 인큐베이터에서 배양 접시(한 번에 하나씩)를 꺼냅니다.
- 개방형 유리 피펫을 사용하여 각 색종이 조각에 한 조각씩 조심스럽게 옮깁니다.
참고: 조각은 색종이 조각의 중앙에 평평하게 놓여야 합니다. 이를 위해서는 약간의 기술이 필요합니다. 그러나 일부 슬라이스가 완벽하지 않은 경우 가능한 한 빨리 모든 슬라이스를 인큐베이터에 넣는 것이 중요하므로 이동하는 데 시간을 소비하는 것보다 그대로 두는 것이 좋습니다. - 유리 피펫(뾰족한 끝)을 사용하여 슬라이스를 건드리지 않고 과도한 매체를 부드럽게 제거합니다.
참고: 배양 중에는 슬라이스를 액체에 담그면 안 됩니다. 따라서 초과 매체는 슬라이스가 공기에 노출되도록 흡입해야 합니다(매체의 박막은 여전히 슬라이스를 덮습니다). 액체에 잠긴 상태로 남아 있는 조각은 일반적으로 건강에 해롭거나 죽습니다(4 및 관찰). - 모든 색종이 조각에 한 조각이 있으면 접시를 인큐베이터로 다시 옮깁니다.
- 1.7.8단계를 반복합니다. - 1.8.4. 요리 #2용.
- 문화권 매체를 변경합니다.
참고: 이것은 슬라이스 다음 날(시험관 1일차, DIV1)에 수행해야 하며 그 이후에는 2-3일마다 수행해야 합니다. - 배양 배지를 수조 또는 인큐베이터에서 예열합니다.
- 멸균 후드에서 진공 흡입 또는 멸균 팁이 있는 일반 피펫을 사용하여 각 웰에서 배양 배지를 흡인합니다. 이것은 접시를 부드럽게 기울이고(약 30도) 피펫 팁을 배양 인서트의 가장자리에 놓음으로써 수행됩니다.
- 각 웰에서 약 800μL를 제거합니다(인서트 바닥이 배지로 덮인 상태로 유지될 수 있을 만큼의 매체만 남겨둡니다). 그런 다음 깨끗한 피펫을 사용하여 예열된 매체 800μL를 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 접시를 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다.
2. 바이러스 형질도입
- 관심 플라스미드를 가진 아데노 관련 바이러스(AAV)를 구매하거나 만듭니다.
참고: 이 프로토콜은 희소돌기아교세포 미토콘드리아를 시각화하기 위해 미엘린 염기성 단백질 프로모터12(AAV2/8 MBP_mito_dsred 또는 AAV2/8 MBP_mito_GFP)의 전사 제어 하에 있는 리포터 유전자로 미토콘드리아 표적 dsred 또는 GFP를 운반하는 AAV 혈청형 2/8(AAV 2/8)을 사용하는 것을 설명합니다. 일반 CAG 프로모터(AAV 2/8 CAG_GFP 또는 AAV 2/8 CAG_tdtomato)에 의해 구동되는 리포터 유전자로 GFP 또는 tdtomato를 운반하는 AAV 2/8은 희소돌기아교세포 세포질을 시각화하는 데 사용됩니다. 따라서 AAV2/8 MBP_mito_dsred와 AAV 2/8 CAG_GFP의 조합은 희소돌기아교세포에서 적색 미토콘드리아와 녹색 세포질을 제공하는 반면, AAV2/8 MBP_mito_GFP와 AAV 2/8 CAG_tdtomato를 결합하면 녹색 미토콘드리아와 적색 세포질을 제공합니다. 구성은 다른 곳에서 더 자세히 설명되어 있습니다 13. - 위치 시험관 내 7일차(DIV7)에 AAV가 있는 희소돌기아교세포를 형질도입합니다.
주의: AAV로 작업할 때 안전 규정을 따르십시오. 적절한 교육과 필요한 생물 안전 수준 승인을 받았는지 확인하십시오. 다음 사항은 모두 장갑과 실험복을 사용하여 Class II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 여기에서는 AAV를 절편의 피질 영역에 적용하는 것이 설명되는데, 이 영역이 최상의 회복을 보이는 영역이기 때문입니다. - 예열된(37°C) 배양 배지에서 AAV를 희석합니다. 2 × 109 게놈 사본/mL(GC/mL) 정도의 희석을 통해 희소돌기아교세포의 희소성 이식을 얻어 슬라이스 내 단일 세포를 이미징할 수 있습니다. 그러나 특정 실험에 적합한 형질도입된 희소돌기아교세포의 밀도를 보장하기 위해 다른 역가를 사용하는 파일럿을 수행해야 합니다. 두 개의 서로 다른 AAV를 사용하는 경우 동일한 용액에 혼합하고 동시에 슬라이스에 추가해야 합니다.
- 각 슬라이스에 약 1.3μL 희석된 AAV를 추가합니다. 피펫 팁의 바깥쪽이 건조한지 확인하십시오. 1.3 μL 희석된 AAV를 피펫으로 만들고 피펫 팁으로 슬라이스를 건드리지 않고(약 1mm 거리) 피펫 위를 가능한 한 가깝게 유지합니다.
- 그런 다음 피펫에서 용액을 천천히 밀어냅니다. 용액이 슬라이스에 닿을 때, 피펫 팁을 피텍스 위로 움직여 용액을 전체 피질 영역에 펴 바릅니다.
참고: 이 절차는 슬라이스가 필요 이상으로 오래 후드에서 벗어나지 않도록 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. 한 번에 한 접시에 이 작업을 수행하고 접시 #2를 시작하기 전에 첫 번째 접시를 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 조직을 손상시키지 않고 AAV를 만족스럽게 분포시키려면 약간의 연습과 꾸준한 노력이 필요합니다.
- 세포 실험실에서 정립 형광 현미경을 사용할 수 있는 경우, 접시를 현미경 아래에 놓아 배양 기간 동안 단백질 발현을 확인할 수 있습니다.
참고: 접시를 인큐베이터 밖으로 2-5분 이상 보관해서는 안 됩니다.
3. 타임랩스 이미징
참고: 이미징은 형광 마커의 발현 수준이 충분하고 슬라이스가 건강해 보일 때마다(보통 DIV11-14) 수행할 수 있습니다.
- 기포 이미징 용액이 가열되고 수조에 들어가고 나올 수 있도록 현미경, 관류 및 가열이 올바르게 설정되었는지 확인하십시오.
참고: 욕실에는 다양한 솔루션이 있습니다. 간단한 버전이 여기에 나와 있습니다. - blu-tack/fun 압정으로 욕조 측면에 부착된 뭉툭한 주사기 바늘(~45°로 구부러짐)로 욕조의 안팎을 만듭니다.
- 튜브가 지속적으로 기포된 이미징 용액 병에서 연동 펌프를 거쳐 히터 장치의 가열 튜브를 통과한 다음 수조의 주입구 주사기 바늘로 이동하는지 확인합니다.
- 다른 튜브를 주사기 바늘 배출구에 연결합니다. 그런 다음 이 튜브는 연동 펌프를 통해 이미징 용액 병(또는 폐기물 병)으로 다시 이동합니다.
- 바이옥사이드 가스를 사용한 버블 이미징 솔루션.
참고: 이것은 이미징 최소 15분 전에 시작해야 하며 실험 내내 계속해야 합니다. - 연동 펌프와 히터를 켜고 용액을 수조를 통해 실행하여 최적의 수조 온도(37 ± 0.5 °C)를 얻습니다. 온도 장치에 연결된 온도계 센서가 수조 용액에 잠겨 있는지 확인하십시오.
- 현미경, 형광 램프, 적절한 레이저를 켭니다.
- 샘플에 적합한 광 경로를 설정합니다.
참고: 이것은 현미경 설정 및 프로브에 따라 다릅니다. 컨포칼 현미경 사용 방법에 대한 일반적인 지식이 필요하며 여기서는 다루지 않습니다. - 적절한 배율과 개구수(n.a.)가 있는 Water Immersion Objective를 사용하십시오. 우리는 40x Water Immersion Plan-apochromat 대물렌즈(n.a. 1.0)를 사용합니다.
- 타임랩스 비디오를 위해 약 2 - 2.5 μm의 광학 단면을 얻기 위해 핀홀을 엽니다. 이렇게 하면 타임랩스 중에 미토콘드리아가 초점에서 벗어나는 현상이 줄어듭니다.
- 유기형 슬라이스를 수조로 옮깁니다:
- 작은 플라스틱 페트리 접시에 이미징 용액 또는 배양 배지 한 방울을 떨어뜨립니다.
- 멸균 후드에서 멸균 집게를 사용하여 멤브레인 인서트에서 드롭으로 하나의 유기형 슬라이스를 옮깁니다. 집게는 색종이 조각에만 닿아야 하고 조각에는 닿지 않아야 합니다.
- 페트리 접시에 뚜껑을 덮습니다.
- 나머지 조각이 들어 있는 배양 접시를 즉시 인큐베이터에 다시 넣으십시오.
- 슬라이스가 들어있는 페트리 접시를 현미경으로 가져옵니다.
- 슬라이스를 현미경 수조로 옮기는 동안 연동 펌프를 끕니다. 먼저 집게를 사용하여 페트리 접시에서 조각이 있는 색종이 조각을 욕조 상단으로 들어 올립니다(색종이 조각이 떠오릅니다). 그런 다음 색종이 조각의 양쪽에 집게의 두 끝을 놓아 조각을 건드리지 않고 색종이 조각에 닿도록 하고 용액을 통해 색종이 조각을 욕조 바닥으로 밀어 넣습니다. 색종이 조각을 욕조 중앙의 중앙에 놓습니다.
- 집게를 사용하여 슬라이스를 건드리지 않고 색종이 조각 위에 고정 앵커(하프)를 놓습니다.
참고: 하프는 말굽 모양의 백금 닻으로, 조각이 욕조에 뜨거나 떠다니는 것을 방지하는 데 사용됩니다. 예리한 슬라이스의 경우 얇은 현이 하프의 한쪽에서 다른 쪽으로 이어집니다(음악 하프와 유사). 유기형 슬라이스의 경우 하프는 끈이 없어야 하며 슬라이스를 건드리지 않고 색종이 조각 위에 놓을 수 있는 방식으로 색종이 조각의 크기에 맞아야 합니다. - 연동 펌프를 다시 켭니다.
- 대물렌즈를 샘플까지 낮춥니다.
- 이미지화할 셀과 영역을 선택합니다.
참고: 세포 독성을 유발할 수 있으므로 세포를 레이저 광에 과도하게 노출시키지 마십시오(아래 요점의 팁 참조). - 접안렌즈와 형광등을 사용하여 올바른 발현을 가진 건강해 보이는 희소돌기아교세포를 찾으십시오. 일반적으로 형광 단백질의 과발현이 강한 희소돌기아교세포는 건강하지 않은 것처럼 보입니다. 건강하지 않은 희소돌기아교세포는 얼룩덜룩한 모양의 돌기를 가지며 미토콘드리아는 단편화된 것처럼 보입니다. 건강한 희소돌기아교세포에서는 체세포와 돌기가 매끄럽게 나타나고 미토콘드리아는 다양한 길이를 가지고 있습니다(일반적으로 뉴런 및 성상세포보다 훨씬 짧지만).
- 관심 있는 셀을 시야의 중간에 배치합니다.
- 소프트웨어(Leica 및 Zeiss 현미경용)의 "라이브" 기능을 사용하여 화면에서 세포를 식별하고 관심 영역(예: 여러 기본 돌기 또는 미엘린 초, 단일 돌기 또는 미엘린 수초를 포함하는 세포 부분)을 선택합니다.
참고: 가능한 한 많은 프로세스/외피를 이미지화할 수 있으려면 x-y 방향으로 비교적 평평하게 놓인 프로세스를 포함하는 영역을 선택하십시오. - 관심 영역을 확대합니다(일반적으로 픽셀 크기가 0.14 - 0.30 μm인 이미지 생성).
- "영역" 도구를 사용하여 영역 주위에 직사각형을 그리고 선택한 영역만 스캔하는 옵션을 선택합니다. 스캔 시간과 그에 따른 레이저 노출은 선택한 영역만 스캔함으로써 줄어듭니다.
참고: 수평 직사각형 영역은 필요한 스캔된 선의 수가 더 적기 때문에 수직 영역보다 더 빠르게 스캔됩니다. 수직 직사각형 영역을 스캔하는 경우 스캔 필드를 90도 회전하여 스캔 시간을 줄일 수 있습니다(회전 도구 사용).
- 레이저 출력과 게인을 조정하여 미토콘드리아를 잘 볼 수 있습니다.
참고: 필요한 최소한의 레이저 출력을 사용하십시오. 가능하면 레이저 출력을 높이는 대신 게인을 높이십시오. 세포 독성을 유발하는 것 외에도 레이저 출력이 너무 높으면 시간이 지남에 따라 이미징된 물체가 표백되므로 스캔 중에 레이저 출력 또는 게인을 더 증가시켜야 합니다. 필요한 레이저 출력과 게인은 표현 수준과 현미경에 따라 달라집니다. LSM700 컨포칼 현미경을 사용하면 20-40μW의 출력에서 555nm 레이저를 사용하여 dsred 또는 tdtomato를 이미지화하고, 20 - 30μW에서 488nm 레이저를 사용하여 GFP(대물렌즈의 후면 조리개에서 측정된 레이저 출력)를 이미징합니다. 게인은 라이브 이미징의 경우 일반적으로 GFP의 경우 700 - 800, dsred 및 tdtomato의 경우 850-980 범위로 높게 설정됩니다. 게인이 높으면 배경 잡음이 더 많아질 수 있으며, 이는 디지털 오프셋을 증가시켜 제거됩니다(오프셋 값은 일반적으로 0에서 15 사이입니다). 우리의 경험에 따르면 MBP_mito_GFP를 사용하면 MBP_mito_dsred보다 더 나은 신호 대 잡음비를 제공합니다. 위치 - 스캔 속도를 선택합니다.
참고: 빠른 스캔 속도를 사용하고 작은 스캔 영역을 그려 스캔 시간을 최소화합니다(아래 4.10.5 참조). 또한 양방향 스캔을 수행하여 스캔 시간을 절약할 수 있습니다. 그러나 이미지 품질이 좋지 않기 때문에 권장하지 않습니다. - 타임랩스 녹화의 빈도와 지속 시간을 설정합니다(예: 희소돌기아교세포의 미토콘드리아 이미징을 위해 총 20분 동안 2초마다 이미지 캡처).
참고: 빈도와 지속 시간은 관심 물체의 이동성에 따라 설정되어야 합니다. 주파수가 높을수록 표본이 더 많은 레이저 광선에 노출되지만 빠르게 움직이는 물체는 타임랩스 비디오의 총 지속 시간도 짧아집니다(예: 희소돌기아교세포의 미토콘드리아보다 더 자주 그리고 훨씬 더 빠른 속도로 움직이는 뉴런의 미토콘드리아는 일반적으로 총 2분 동안 1초마다 이미지화됩니다16). - 타임랩스 녹화를 시작합니다.
참고: 미토콘드리아는 기록 중에 초점에서 벗어나거나 이미지 영역에서 벗어날 수 있습니다. 진동과 움직임을 최소화하려면 수조의 내부와 배출구를 조정하고 필요한 경우 펌프 속도를 줄이십시오. 일반적으로 초점의 작은 변화는 여전히 발생합니다. 따라서 이미징 중 화면의 지속적인 모니터링이 필요하며 녹화 중에 초점을 약간 조정해야 합니다.
나중에 세포와 이미징된 과정을 식별하기 위해 전체 세포의 z-스택을 캡처합니다.
참고: 더 나은 해상도를 위해 핀홀은 z-스택에 대해 1 airy 단위로 재설정되어야 합니다.