쥐 뇌 절편의 화합물에 대한 미세아교세포 돌기 인력을 연구하기 위한 이광자 현미경

초록

출처: Etienne, F. et al. 급성 뇌 절편에서 ATP 또는 세로토닌에 대한 미세아교세포 과정의 인력에 대한 이광자 이미징. J. Vis. Exp. (2019)

이 비디오는 이광자 현미경을 사용하여 뇌 절편에 주입된 화합물에 대한 미세아교세포의 인력을 연구하는 방법을 보여줍니다. 쥐의 뇌 절편을 준비하고, 화학유인제 테스트 화합물을 주입하고, 형광 표지된 미세아교세포를 이미징하여 반응을 시각화하는 방법에 대한 개요를 제공합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

결과

그림 1: 인터페이스 챔버 세부 정보. (A) 슬라이스 홀더의 3D 프린팅 개요. 홀더의 외경은 7cm입니다. (B) 나일론 메쉬(화살표)가 있는 인터페이스 슬라이스 홀더로, 연구원이 액체-공기 계면에서 슬라이스를 유지할 수 있습니다. (C) 이미징하기 전에 발암(화살표는 버블링을 위한 튜브를 나타냄) 및 가습된 환경에서 슬라이스를 유지할 수 있도록 하는 인터페이스 챔버 장치입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
for slice imaging
× 25 0.95 NA 침수 objective	Leica Microsystems (Germany)	HCX Irapo
공진 스캐너(8kHz)와 두 개의 HyD 하이브리드 검출기가 있는 2-photon MP5 직립 현미경	Leica Microsystems (독일)
Antlia-3C Digital Peristaltic pump	DD Biolab	178961	CSF를 사용한 2-광자 챔버 관류<
carbogen 5% 이산화탄소/95% 산소	Air Liquide France Industrie	I1501L50R2A001
카멜레온 Ultra2 Ti:사파이어 레이저	Coherent (독일)
일회용 전송 피펫, 넓은 입	ThermoFischer scientific	예 : 232-11	5.8ml 핀 팁이 있지만 직경 4mm의 입을 갖도록 (약 7cm) 자릅니다
방출 필터 SP680	Leica Microsystems (독일)
525/50 방출 필터와 560 이색성 필터를 포함하는 형광 큐브(형광 수집용)	Leica Microsystems (독일)
슬라이스의 일정한 관류를 유지하기 위해 50mL의 ACSF가 있는 유리 비커		<
난방 시스템	워너 인스트루먼트 코퍼레이션	자동 히터 컨트롤러 tc-324B	32°C에서 관류 용액을 유지하려면
Perfusion chamber			home-made, 3D 프린팅용 파일은 추가 자료에 제공됩니다.
슬라이스 홀더 ("harp")			home made : 평행한 나일론 실로 연결된 두 개의 분기가 있는 백금으로 만든 머리핀
슬라이스 자극의 경우
아데노신 5'-트리포스페이트 디소듐 염 수화물(ATP)	Sigma	A-26209	즉시로 준비하기 위해 : 1mg/ml(3mM) 원액을 실험 당일에 준비하여 4°C(몇 시간)로 유지하고 사용 직전에 희석했습니다
Fluorescein (선택 사항)	Sigma	F-6377	1μM final에서 사용
Micromanipulator	루이그와 노이만	SM7	마이크로피펫에 연결됨
Micropipette holder			eletrophysiology와 동일
세로토닌 염산염	Sigma	H-9523	분취액은 -20°C로 유지되었습니다. 500μM 용액은 실험 당일에 준비되었습니다.
주사기 5mL (바늘 제외)	Terumo medical products	SS+05S1
transparent tubing	Fischer Scientific	11750105	Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing
이미지 분석용
Fiji		https://fiji.sc
Icy	파스퇴르 연구소	http://icy.bioimageanalysis.org
Mice
CX3CR1-GFP 마우스	Jung et al, 2000		수컷 또는 암컷, P3에서 2개월; 우리는 129SV 배경에서 이 마우스를 역교배했습니다.
CX3CR1creER-YFP mice	Parkhurst et al 2013		남성 또는 여성, P3에서 2개월; 우리는 129sv 배경에서 이 마우스를 역교차했습니다.

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