쥐 뇌 절편의 화합물에 대한 미세아교세포 돌기 인력을 연구하기 위한 이광자 현미경

초록

출처: Etienne, F. et al. 급성 뇌 절편에서 ATP 또는 세로토닌에 대한 미세아교세포 과정의 인력에 대한 이광자 이미징. J. Vis. Exp. (2019)

이 비디오는 이광자 현미경을 사용하여 뇌 절편에 주입된 화합물에 대한 미세아교세포의 인력을 연구하는 방법을 보여줍니다. 쥐의 뇌 절편을 준비하고, 화학유인제 테스트 화합물을 주입하고, 형광 표지된 미세아교세포를 이미징하여 반응을 시각화하는 방법에 대한 개요를 제공합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 이광자 현미경

1. 매개변수 설정{{TAG_29{{TAG_30다광자 시스템(하이브리드 검출기, 레이저, 스캐너, 전기 광학 변조기, 현미경)을 켭니다.
2. 920nm에서 레이저를 조정하고 레이저가 모드 잠금되어 있는지 확인한 다음 출력을 5% - 15%로, 게인을 10%로 설정합니다. 이는 대물렌즈 아래에서 3 - 5mW의 전력에 해당합니다. 디스캔되지 않은 감지기가 작동하고 적절한 방출 및 여기 필터가 설치되어 있는지 확인합니다.
3. 이미징 소프트웨어의 매개 변수를 다음 값으로 설정하십시오 : 프레임 크기의 경우 295.07 x 295.07 μm의 영역에 해당하는 1024 x 1024 픽셀; 확대/축소의 경우 2. 신호에 잡음이 심하면 라인 평균으로 2를 적용합니다. 픽셀 역학의 경우 이미징 소프트웨어를 12비트 이상으로 설정합니다.
   참고: 비트 값이 높은 이미지는 연구자들이 낮은 비트 값을 가진 이미지보다 형광 강도의 더 작은 차이를 구별할 수 있도록 합니다: 8비트 이미지에서 하나의 회색 값 변경은 12비트에서 16개의 회색 값 및 16비트 이미지에서 256개의 회색 값 변경에 해당합니다. 따라서 더 높은 비트 이미지는 정량적 분석에 더 적합하지만 비트 깊이에 따라 크기가 증가함에 따라 스토리지 용량과 컴퓨팅 성능이 제한될 수 있습니다.
4. 2μm에서 Z-간격 범위와 2분의 T-간격으로 스캔 모드 XYZT를 선택합니다.
   참고: x, y 및 z 해상도는 Nyquist 샘플링 정리에 의해 결정됩니다. 약 0.8의 Z-step 크기는 미세아교세포(직경 <1μm)를 분해하는 데 최적이지만 다광자 현미경의 광학 해상도는 제한적입니다(0.95NA 대물렌즈의 920nm에서 축 분해능은 약 1μm). 이러한 물리적 장벽 외에도 라이브 이미징 실험에서는 감도 또는 신호 대 잡음비, 해상도, 속도 및 총 관찰 시간이 중요합니다. 이러한 모든 매개변수를 고려하여 2μm의 z-단계, 1024 x 1024 픽셀의 이미지 크기 및 HyD 검출기에 연결된 공진 스캐너를 사용한 고속 획득(50개의 z-플랜을 획득하는 데 약 15초 소요)이 여기에서 선택되었습니다. 획득 빈도는 2분마다 하나의 XYZT 시리즈이며 총 지속 시간은 30분입니다. 설정이 충분히 빠르지 않거나 민감하지 않은 경우 측면 해상도(512 x 512까지) 또는 z-슬라이스 수를 줄일 수 있습니다(가장 강한 형광 [즉, 형광이 희미한 가장 깊은 z-슬라이스가 아닌 를 나타내는 z-깊이에서만 이미징하여]), 또는 스캐너의 속도를 줄입니다. z-단계를 최대 3μm까지 증가시켜 축 분해능을 줄일 수도 있지만, 이는 정량화에 영향을 미칠 수 있으므로 비교할 모든 실험은 동일한 z-단계로 수행해야 합니다.
   참고: 미세아교세포에서만 유전자 결실을 유도하는 데 사용되는 마우스라인인 CX3CR1creER-YFP 마우스의 슬라이스에 대해 유사한 실험을 수행할 수 있습니다. 그러나 YFP의 발현 수준은 CX3CR1^GFP/+ 마우스에서 녹색 형광 단백질(GFP)에 비해 매우 낮습니다. 따라서 이미징은 가능하지만 까다로우며 획득 매개변수의 최적화가 필요합니다. 다음과 같이 조정하는 것이 좋습니다.
5. 970nm(920nm보다 YFP 여기에 더 적합함)에서 레이저를 조정하고, 50%에서 출력을, 50%에서 게인을 조정하며, 이는 5 - 6mW의 대물렌즈에서 레이저 출력에 해당합니다.
6. 신호 대 잡음 비율을 개선하기 위해 라인 평균을 4(또는 그 이상)로 설정합니다.

슬라이스와 유리 마이크로피펫의 위치 및 화합물의 현지 적용

1. {{}}기록 시작 30분 전에 연동 펌프를 기록 챔버에 연결합니다. 50mL의 초순수로 전체 관류 시스템을 세척한 후 일정한 발암 상태에서 유리 비커에 포함된 CSF(50mL)로 기록 챔버의 관류를 시작합니다. 실험 내내 인라인 마이크로히터 또는 펠티에 히터를 사용하여 순환 aCSF를 32°C로 유지합니다.
   참고: 상단 및 하단 관류가 있는 특정 관류 챔버는 슬라이스 양쪽의 산소화를 최적화하도록 설계되었습니다. 관류 챔버는 완벽하게 맞는 두 개의 부품으로 구성되며, 그 사이에 폴리아미드 메쉬가 뻗어 있습니다(TAG_129 TAG_128 TAG_127그림 1A,B). 슬라이스가 유리 커버슬립 위에 직접 놓이는 다른 유형의 챔버와 비교할 때, 이 챔버는 슬라이스의 바닥 부분에서 뉴런 사멸을 줄이고 생존력을 개선하며 팽창으로 인한 슬라이스 움직임을 줄입니다.
2. 입이 넓은 일회용 전사 피펫을 사용하여 이미징할 뇌 절편을 aCSF 비커로 전송하여 렌즈 용지를 제거하고 가라앉히고(기포가 부착되지 않았다는 증거로) 기록(관류) 챔버로 전송합니다.
3. 슬라이스 홀더(두 가지가 평행한 나일론 실로 연결된 백금으로 만든 헤어핀)를 슬라이스에 배치하여 관류 흐름으로 인한 슬라이스 움직임을 최소화합니다.
4. 명시야 조명을 사용하여 저배율 대물렌즈(5X 또는 10X)를 사용하여 관심 뇌 영역(노출 시간: 50 - 80ms)을 표적으로 삼습니다. 더 높은 배율(0.35x 렌즈의 경우 25x) 침수 대물렌즈로 전환하고 위치를 조정합니다.
   참고: 슬라이스 홀더의 나일론 실에 가까운 필드는 빛을 차단하고 슬라이스를 국부적으로 변형시킬 수 있으므로 이미지를 생성하지 마십시오. 관심 영역이 평평한지 확인하십시오. 필요한 경우 슬라이스 및/또는 슬라이스 홀더의 위치를 변경하기 위해 슬라이스 홀더를 제거합니다.
5. 형광 조명을 사용하여 현장에서 이미징할 형광 미세아교세포를 찾습니다(노출 시간: 250 - 500ms).
   참고: 이 단계를 통해 연구자는 관심 영역의 세포 존재 여부와 형광 강도를 확인하고 세포 파편의 양을 제어할 수 있습니다.
6. ATP, 5-HT 또는 최종 농도에서 관심 약물이 포함된 10μL의 aCSF로 피펫을 다시 채웁니다. 팁을 아래쪽으로 향하게 하고 약물이 채워진 피펫을 부드럽게 흔들어 팁에 갇힌 기포를 제거합니다.
   참고: 주입할 용액이 기포를 형성하는 경향이 있는 경우 내부 필라멘트가 있는 붕규산 피펫을 사용하는 것이 좋습니다. 피펫 외부로 ATP가 누출되면 주입 전에도 미세아교세포과정을 유인할 수 있습니다(이 경우 분석 단계에서 볼 수 있음). 이는 사용된 ATP 농도(500 μmol·L^-1)에 따라 보통이어야 하지만, 문제가 있는 경우 1.2.6단계에서 ATP(또는 기타 화합물) 용액을 추가하기 전에 마이크로피펫에 2mL의 aCSF를 미리 채우는 것이 좋습니다.
7. 주입된 피펫을 투명 튜브로 5mL 주사기에 연결하고 플런저를 5mL 위치에 놓고 피펫 홀더에 장착합니다. 피펫 홀더 자체는 3축 micromanipulator에 장착됩니다.
8. 명시야 조명 아래에서 micromanipulator를 사용하여 피펫을 필드 중앙에 배치합니다. 재현 가능하고 최적의 센터링을 위해 이미지에 눈금자를 표시하고 사용하십시오.
9. 피펫을 슬라이스 쪽으로 부드럽게 내리고 피펫 팁이 슬라이스 표면에 가볍게 닿을 때까지 대물렌즈를 제어하고 조정합니다. 슬라이스가 닿은 것이 보이는 즉시 피펫의 하강을 중지하면 피펫 팁이 슬라이스 표면의 80 - 100 μm를 관통할 수 있습니다(TAG_216 TAG_215 TAG_214그림 2B 참조).
10. 레이저를 조정하고(위의 매개변수 참조) 현미경을 다광자 모드로 전환합니다. 챔버가 모든 광원(예: 컴퓨터 화면)으로부터 차폐되는지 확인하십시오. 디스캔되지 않은 감지기를 켜고 게인을 설정합니다. 색상으로 구분된 상한이 있는 LUT(룩업 테이블)를 사용하여 이미지의 픽셀이 포화되지 않도록 합니다.
11. 이미징할 슬라이스의 두께(즉, 형광이 검출되는 위쪽 및 아래쪽 z 위치[일반적으로 총 220 및 290 μm 사이])를 결정합니다.
    참고: 슬라이스의 표면에는 과정의 밀도가 증가하며, 슬라이스 내부와 비교하여 종종 특이한 형태를 가진 미세아교세포가 있을 수 있습니다. 이 축적은 시간이 지남에 따라 더 두드러질 것입니다(예: .{ {TAG_244}}, 이미지화된 첫 번째 뇌 절편보다 마지막에 더 잘 보입니다). 따라서 첫 번째 ~30μm의 z-평면은 분석에 사용해서는 안 되며 획득을 위해 건너뛸 수도 있습니다.
12. 총 30분(또는 원하는 경우 그 이상) 동안 기록을 시작하고 5분 기준선 후에 테스트할 화합물을 국부적으로 적용합니다(이미징을 중단하지 않음). 이렇게하려면 마이크로 피펫에 연결된 주사기의 플런저를 5mL에서 1mL 위치로 천천히 누릅니다 (약 5 초 내). 플런저를 누를 때 저항은 즉시 느껴져야 합니다. 그렇지 않으면 팁이 파손되었을 수 있습니다.
    참고: 훈련된 실험자의 경우 이 방법을 사용한 주입을 재현할 수 있지만 주사기를 수동으로 조작하는 대신 피펫을 자동 압력 배출 시스템에 연결하여 전달되는 부피를 더 잘 제어할 수 있습니다. 주입은 주입 부위에서 슬라이스의 물리적 왜곡을 생성합니다. 이러한 왜곡은 주입 후 처음 2개 또는 3개의 이미지에서 후방적으로 볼 수 있지만 네 번째 이미지(즉, 주입 후 8분)에서는 보이지 않아야 합니다. 문제가 지속되면 피펫 준비에 대한 매개변수를 변경하는 것이 좋습니다.
13. 획득이 끝나면(30분) 마이크로피펫을 버리고 슬라이스를 제거합니다.
14. 새로운 슬라이스 이미지를 시작하기 전에 2D 동영상(섹션 2.1)을 만들어 미세아교세포가 정상적인 형태를 가지고 움직이고 있는지, 따라서 슬라이스가 건강한지 확인합니다.

2. 미세아교세포돌기의 인력 분석

1. 2D 투영 및 드리프트 보정
   1. 파일을 엽니다 (. LIF)와 함께 피지와 함께합니다.
   위치
   2. 필요한 경우 관심 있는 z-평면만 사용하여 하위 스택(Image/Stacks/Tools/Make Substack)을 만듭니다. 예를 들어, 슬라이스의 표면에 해당하는 z-평면이 획득되었지만 분석에 사용되지 않는 경우(1.2.11단계 이후의 참고 참조) 형광이 없는 가장 깊은 z-평면을 제외합니다. 최종 스택에는 일반적으로 90 - 110 z-슬라이스(180 - 220 μm)가 포함됩니다.
   3. Z 프로젝트 함수(이미지/스택/Z 프로젝트")를 실행하고 최대 강도 프로젝션 유형을 선택하여 각 시점에서 획득한 Z-스택의 프로젝션을 만듭니다.
   4. MultiStackReg 플러그인(Plugin/Registration/MultiStackReg)을 실행하고 Align 및 Transformation을 선택합니다. Rigid Body는 획득 중에 발생했을 수 있는 약간의 드리프트를 수정합니다. 이 2D 동영상을 새 파일(.tiff)로 저장합니다.
2. 데이터 처리
   1. Icy로 이 새 파일을 엽니다.
   2. 주입 부위를 중심으로 직경 35μm의 원형 R1 관심 영역(ROI)을 그립니다(특히 피펫의 그림자와 주입 시 생성된 왜곡으로 식별됨).
   3. 플러그인 ROI intensity evolution을 사용하고 R1에서 시간 경과에 따른 평균 강도를 측정합니다.
   4. 결과를 .XLS 파일에 저장합니다.
3. 결과의 정량화 및 표현
   1. 시간 경과에 따른 미세아교세포 반응을 정량화하려면 각 시점에서 결정하십시오.
      그런 다음, 결과는 미세아교세포 반응의 동역학 또는 특정 시점으로 나타낼 수 있습니다(그림 그림 3 참조).

결과

그림 1: 인터페이스 챔버 세부 정보. (A) 슬라이스 홀더의 3D 프린팅 개요. 홀더의 외경은 7cm입니다. (B) 나일론 메쉬(화살표)가 있는 인터페이스 슬라이스 홀더로, 연구원이 액체-공기 계면에서 슬라이스를 유지할 수 있습니다. (C) 이미징하기 전에 발암(화살표는 버블링을 위한 튜브를 나타냄) 및 가습된 환경에서 슬라이스를 유지할 수 있도록 하는 인터페이스 챔버 장치입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
for slice imaging
× 25 0.95 NA 침수 objective	Leica Microsystems (Germany)	HCX Irapo
공진 스캐너(8kHz)와 두 개의 HyD 하이브리드 검출기가 있는 2-photon MP5 직립 현미경	Leica Microsystems (독일)
Antlia-3C Digital Peristaltic pump	DD Biolab	178961	CSF를 사용한 2-광자 챔버 관류<
carbogen 5% 이산화탄소/95% 산소	Air Liquide France Industrie	I1501L50R2A001
카멜레온 Ultra2 Ti:사파이어 레이저	Coherent (독일)
일회용 전송 피펫, 넓은 입	ThermoFischer scientific	예 : 232-11	5.8ml 핀 팁이 있지만 직경 4mm의 입을 갖도록 (약 7cm) 자릅니다
방출 필터 SP680	Leica Microsystems (독일)
525/50 방출 필터와 560 이색성 필터를 포함하는 형광 큐브(형광 수집용)	Leica Microsystems (독일)
슬라이스의 일정한 관류를 유지하기 위해 50mL의 ACSF가 있는 유리 비커		<
난방 시스템	워너 인스트루먼트 코퍼레이션	자동 히터 컨트롤러 tc-324B	32°C에서 관류 용액을 유지하려면
Perfusion chamber			home-made, 3D 프린팅용 파일은 추가 자료에 제공됩니다.
슬라이스 홀더 ("harp")			home made : 평행한 나일론 실로 연결된 두 개의 분기가 있는 백금으로 만든 머리핀
슬라이스 자극의 경우
아데노신 5'-트리포스페이트 디소듐 염 수화물(ATP)	Sigma	A-26209	즉시로 준비하기 위해 : 1mg/ml(3mM) 원액을 실험 당일에 준비하여 4°C(몇 시간)로 유지하고 사용 직전에 희석했습니다
Fluorescein (선택 사항)	Sigma	F-6377	1μM final에서 사용
Micromanipulator	루이그와 노이만	SM7	마이크로피펫에 연결됨
Micropipette holder			eletrophysiology와 동일
세로토닌 염산염	Sigma	H-9523	분취액은 -20°C로 유지되었습니다. 500μM 용액은 실험 당일에 준비되었습니다.
주사기 5mL (바늘 제외)	Terumo medical products	SS+05S1
transparent tubing	Fischer Scientific	11750105	Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing
이미지 분석용
Fiji		https://fiji.sc
Icy	파스퇴르 연구소	http://icy.bioimageanalysis.org
Mice
CX3CR1-GFP 마우스	Jung et al, 2000		수컷 또는 암컷, P3에서 2개월; 우리는 129SV 배경에서 이 마우스를 역교배했습니다.
CX3CR1creER-YFP mice	Parkhurst et al 2013		남성 또는 여성, P3에서 2개월; 우리는 129sv 배경에서 이 마우스를 역교차했습니다.

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