Golgi-Cox 금속 염색을 사용한 마우스 뇌 절편의 뉴런 현미경 이미징

초록

출처: Louth, E. L., et al. Golgi-Cox 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 절편 내의 뉴런을 이미징합니다. J. Vis. Exp. (2017)

이 비디오는 Golgi-Cox로 염색된 두꺼운 뇌 절편에서 상부 및 하부 초점 경계를 설정하고 겹치는 이미지를 캡처하여 뉴런을 이미징하는 방법을 보여줍니다. 상세한 뉴런 투영을 보장하기 위해 여러 위치를 이미지화하고, 이를 결합하여 3D 표현을 생성합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. Golgi-Cox Staining

1. Golgi-Cox 뇌 함침
   1. 중크롬산칼륨을 용해시켜 1%(w/v) 중크롬산칼륨, 0.8%(w/v) 크롬산칼륨, 1%(w/v) 염화수은의 Golgi-Cox 용액을 만듭니다. 그리고 크롬산 칼륨을 고품질 물에 따로 넣습니다. 용액을 혼합하고 염화수은을 첨가한 다음 1등급 여과지를 사용하여 최종 용액을 여과합니다. 용액을 최대 한 달 동안 어두운 곳에 보관하십시오.
   2. 5% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다.
   3. 참수로 쥐를 안락사시키고 뇌를 빠르게 제거하십시오.
   4. 17mL Golgi-Cox 용액이 들어 있는 20mL 유리 섬광 바이알에 뇌를 넣고 25일 동안 실온에서 어둠 속에서 배양합니다.
   5. 44시간 동안 어둠 속에서 4°C에서 40mL의 자당 동결 보호제(0.1M 인산염 완충액에 30%(w/v) 자당, pH 7.4)가 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣어 뇌를 저온 보호합니다.
      참고: 다음 선택적 세 단계는 장기 저장을 위해 이 단계에서 뇌를 동결하기 위해 주요 프로토콜의 대안으로 사용될 수 있습니다.
   6. 드라이 아이스에서 미리 냉각된 200mL 이소펜탄에 뇌를 담가 뇌 전체를 얼립니다.
   7. 얼어붙은 뇌를 50mL 원추형 튜브에 넣고 -80°C의 어두운 곳에 보관하십시오.
   8. 진행할 준비가 되면 40mL의 자당 동결 방지제가 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣고 4°C의 어두운 곳에 24시간 동안 보관하여 뇌를 해동합니다.
2. Brain Sectioning
   1. 자당에서 뇌를 제거하고 면도날로 소뇌를 잘라내고 뇌의 나머지 꼬리 끝에 평평한 가장자리를 남겨 절단을 위해 차단합니다.
   2. 한천이 녹을 때까지 가열(물에 3%(w/v))한 다음 녹는점보다 약간 높을 때까지 식힙니다.
   3. 꼬리 끝이 아래를 향하게 하는 작은 일회용 무게를 잴 수 있는 접시에 뇌를 넣고 그것을 덮을 수 있을 만큼 충분한 양의 녹은 한천을 추가합니다.
   4. 한천이 응고되면, 뇌를 둘러싼 약 2 - 4 mm를 남겨두고 여분의 한천을 다듬고, 소량의 에틸 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 꼬리 끝이 아래를 향하도록 하여 뇌를 비브라톰 단계에 붙입니다.
   5. 진동의 무대 영역을 뇌를 덮을 수 있는 충분한 양의 자당 동결 보호제로 채우고, 86Hz의 진동 주파수와 0.125mm/s의 블레이드 전진 속도를 사용하여 400 - 500 μm(검사할 뇌 영역에 따라 다름)의 슬라이스 두께로 뇌를 절편화합니다.
   6. 작은 페인트 브러시를 사용하여 뇌 절편을 시중에서 판매되는 메쉬 바닥 인서트가 들어 있는 6웰 조직 배양 플레이트의 웰에 넣고 0.1M 인산염 완충액, pH 7.4에 6%(w/v) 자당 10mL로 미리 채웁니다.
   7. 4°C O/N의 어둠 속에서 절편을 배양합니다.
3. Developing Brain Sections
   1. 메쉬 바닥 인서트를 사용하여 0.1M 인산염 완충액, pH 7.4에 2%(w/v) 파라포름알데히드(PBD) 5mL를 포함하는 새로운 웰로 뇌 절편을 전송합니다. 로커에서 배양하고 15 분 동안 RT에서 어둠 속에서 천천히 움직입니다.
   2. 단면은 5mL의 물이 들어있는 새 우물로 옮겨 두 번 씻어야 합니다. 그들은 5 분 동안 RT에서 어둠 속에서 적당한 속도로 움직이는 로커에서 씻어야합니다.
   3. 2.7%(v/v) 수산화암모늄 5mL를 포함하는 새 웰로 절편을 옮깁니다. 로커에서 배양하고 15 분 동안 RT에서 어둠 속에서 천천히 움직입니다.
   4. 단면은 5mL의 물이 들어있는 새 우물로 옮겨 두 번 씻어야 합니다. 그들은 5 분 동안 RT에서 어둠 속에서 적당한 속도로 움직이는 로커에서 씻어야합니다.
   5. 원래 구입한 농도의 10배에 달하는 물에 희석된 5mL의 Fixative A를 포함하는 새로운 우물로 절편을 옮깁니다. 로커에서 배양하고 RT에서 25분 동안 어둠 속에서 천천히 움직입니다.
   6. 단면은 5mL의 물이 들어있는 새 우물로 옮겨 두 번 씻어야 합니다. 그들은 5 분 동안 RT에서 어둠 속에서 적당한 속도로 움직이는 로커에서 씻어야합니다.
4. Mounting Brain Sections
   1. 작은 붓을 사용하여 현미경 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 핀셋과 작은 티슈를 사용하여 여분의 물과 한천을 제거합니다. 탈수를 진행하기 전에 모든 한천이 제거되었는지 확인하십시오.
   2. 약 45분(400μm 섹션) 또는 90분(500μm 섹션) 동안 RT에서 섹션을 자연 건조시킵니다.
      참고: 시기와 적절한 건조 수준은 매우 중요하며 주변 온도와 습도에 따라 각 실험실에서 결정해야 할 수도 있습니다. 건조 시간이 너무 짧으면 후속 탈수 단계에서 슬라이드에서 섹션이 떨어지고 건조 시간이 너무 길면 섹션에 균열이 생길 수 있습니다. 섹션은 적절한 건조 수준에서 여전히 반짝이는 것처럼 보입니다.
   3. 표시된 대로 Coplin 염색 항아리에 슬라이드를 넣어 크레실 바이올렛으로 섹션을 염색합니다.
      참고: 이 선택적 단계는 신경핵을 크레실 바이올렛으로 염색하기 위해 동결된 적이 없는 절편에 사용할 수 있습니다. 우리는 크레실 바이올렛에서 배양하기 전에 절편을 청소하고 재수화하면 절편 전체에 걸쳐 균일한 염색과 낮은 배경으로 이어진다는 것을 발견했습니다.
      1. 5분 동안 세척제에 넣습니다. 한 번 반복합니다.
      2. 100% 에탄올에 5분 동안 넣고 한 번 반복합니다.
      3. 95% 에탄올을 물에 넣고, 75% 에탄올을 물에 넣은 다음 50% 에탄올을 물에 2분 동안 넣습니다.
      4. 5분 동안 물에 담그십시오.
      5. 0.5%(w/v) 크레실 바이올렛에 7분 동안 넣습니다.
      6. 2분 동안 물에 담그고 한 번 반복합니다.
   4. 표시된 대로 슬라이드를 Coplin 염색 항아리에 넣어 섹션을 탈수합니다.
      1. 50% 에탄올을 물에 넣고, 75% 에탄올을 물에 넣고, 95% 에탄올을 물에 각각 2분 동안 넣습니다.
      2. 100% 에탄올에 5분 동안 넣고 한 번 반복합니다.
      3. 5분 동안 투명화제에 넣습니다. 한 번 반복합니다.
         참고: 이러한 탈수 및 제거 시간은 이 원고에 설명된 대로 마우스 뇌를 처리하기에 충분합니다. 그러나 우리는 쥐와 카우버드를 포함한 다른 종의 경우 최종 제거 단계를 총 15분까지 연장해야 할 수도 있음을 관찰했습니다.
   5. 무수 장착 매체를 사용한 커버슬립 섹션.
   6. 슬라이드가 최소 5일 동안 RT에서 어둠 속에서 수평으로 건조되도록 합니다.

2. Imaging Stained Neurons within Thick Brain Sections

1. Capturing Image Stacks
   1. 현미경 전구, 카메라, 무대 컨트롤러를 켭니다.
   2. 현미경 소프트웨어(예: Neurolucida)를 엽니다.
   3. 현미경 스테이지에 슬라이드를 놓습니다.
   4. 1.25X 0.4 N.A. PlanAPO 또는 4X 0.16 N.A와 같은 저배율 대물렌즈를 사용하여 뇌 부분의 2D 와이드 뷰 이미지를 캡처합니다.
      1. 이미지에 초점을 맞추고 노출 시간 및 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다.
      2. <
      span style='background-color:transparent;color:#1a202c;' 섹션의
      3. 아무 곳이나 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 참조점을 만듭니다>이미지 획득 창에서 "단일 이미지 획득"을 선택하여 이미지를 캡처합니다.
   5. 10X 0.3 N.A. UPlan FL N 대물렌즈를 사용하여 관심 뉴런이 포함된 영역의 중간 해상도 이미지 스택을 캡처합니다.
      1. 이미지에 초점을 맞추고 노출 및 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다.
      2. 섹션의 맨 위에 초점을 맞추고 이미지 획득 창 내에서 "스택 상단" 옆에 있는 "설정"을 선택한 다음 섹션 하단에 초점을 맞추고 이미지 획득 창 내에서 "스택 하단" 옆에 있는 "설정"을 선택하여 이미지 스택의 상한 및 하한 경계를 설정합니다.
      3. 이미지 획득 창에서 "이미지 스택 획득"을 선택하여 이미지 스택을 캡처합니다.
      4. 위의 단계를 반복하여 전체 관심 영역을 캡처하여 모든 이미지 스택이 X 및 Y 축에서 10% 이상 겹치도록 합니다.
   6. 30X 1.05 N.A. 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 관심 뉴런이 포함된 영역의 고해상도 이미지 스택을 캡처합니다.
      1. 슬라이드에 실리콘 이멀젼 오일 3-4방울을 떨어뜨리고 대물렌즈를 슬라이드 위에 놓아 대물렌즈와 오일이 접촉하도록 합니다.
      2. 이미지에 초점을 맞추고 노출 및 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다.
      3. 섹션의 맨 위에 초점을 맞추고 이미지 획득 창 내에서 "스택 상단" 옆에 있는 "설정"을 선택한 다음 섹션 하단에 초점을 맞추고 이미지 획득 창 내에서 "스택 하단" 옆에 있는 "설정"을 선택하여 이미지 스택의 상한 및 하한 경계를 설정합니다.
      4. 이미지 획득 창에서 "distance between images" 옆에 "1 μm"를 입력하여 걸음 거리를 1μm로 설정합니다.
      5. 이미지 획득 창에서 "이미지 스택 획득"을 선택하여 이미지 스택을 캡처합니다.
      6. 위의 단계를 반복하여 전체 관심 영역을 캡처하여 모든 이미지 스택이 X 및 Y 축에서 10% 이상 겹치도록 합니다.
   7. 외부 처리를 위해 데이터 파일과 모든 이미지 파일을 TIFF 형식으로 저장합니다.
2. Z-프로젝션 이미지 및 이미지 몽타주 생성
   1. ImageJ에서 Z-프로젝션 이미지 생성
      1. Bio-Formats 플러그인이 설치된 ImageJ 소프트웨어를 엽니다.
      2. "플러그인" -> "bio-formats" -> "bio-formats importer"를 선택합니다.
      3. 열려는 이미지 스택 파일을 선택합니다.
      4. 파일이 열리면 "Image" -> "Type" -> "RGB Color"를 선택하여 형식을 RGB로 변경합니다.
      5. Image" -> "Stacks" -> "Z Project..."를 선택하여 Z-투영을 만듭니다.
      6. 2차원 Z 투영 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다.
   2. 전체 관심 영역의 2차원 이미지 몽타주를 만듭니다.
      1. 소프트웨어를 엽니다(예: Adobe Photoshop).
      2. "파일" -> "자동화" -> "Photomerge"를 선택합니다.
      3. "찾아보기"를 선택한 다음 병합할 모든 이미지 파일을 추가합니다.
      4. "Blend Images"가 선택되어 있는지 확인한 다음 "OK"를 선택합니다.
      5. 전체 관심 영역의 결과 몽타주 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다.

재료