이미징 : Hippocampal Neuronal Activation In Mouse Brain Sections

초록

출처: Provenzano, G., et al. Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders(신경 발달 장애의 마우스 모델에서 공간 학습 후 해마 뉴런 활동의 면역조직화학적 시각화). J. Vis. Exp. (2015)

이 비디오는 해마 신경 세포 활성화를 시각화하기 위한 면역조직화학적 이미징을 보여줍니다. 염색된 뇌 절편은 명시야 현미경으로 더 어두운 영역을 드러내며, 이는 활성화된 뉴런을 나타냅니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 면역조직화학

1. 각 마우스에 대한 3-5개의 등쪽 해마 절편을 각 웰에 대해 500μl의 0.1M 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함하는 24개의 다중 웰 플레이트로 이동합니다.
2. 각 웰에 들어있는 섹션을 500μl의 0.1M PBS로 세척합니다 (5 분, 부드럽게 흔들어 3 회).
3. PBS에서 1% 과산화수소(H₂O₂) 의 단면을 부드러운 교반으로 20분 동안 배양하여 내인성 과산화효소 활성을 억제합니다.
4. 0.1M PBS에서 부드러운 교반으로 섹션을 세척합니다(3 x 5분).
5. 조직의 투과화: PBS에서 0.2% Triton X-100에서 5분 동안 절편을 배양합니다.
6. 위의 단계(1.4; 1.5)에서 전체 실험(절편 x 100μl x 3단계)에 대해 충분한 차단 버퍼(PBS의 경우 10% 염소 혈청 및 0.1% Triton-X100)를 만듭니다.
7. 참고: 2차 항체(Ab)(비오틴에 접합)가 만들어진 것과 동일한 종의 혈청을 사용하십시오.
8. 부드러운 교반과 함께 실온(RT)에서 1시간 동안 차단 완충액(100μl/section)의 절편을 배양하여 항체의 비특이적 결합을 방지합니다.
9. 차단 완충액에 희석된 1차 Ab 인산화 세포외 신호 조절 키나아제(pERK)의 절편을 부드러운 교반으로 4°C에서 밤새 배양합니다.
10. 0.1M PBS에서 부드러운 교반으로 섹션을 세척합니다(3 x 5분).
11. 블로킹 버퍼(1.6단계에서 사용한 것과 동일)에 희석된 비오틴(1:250)과 접합된 2차 Ab를 RT에서 부드러운 교반으로 1시간 동안 배양합니다.
12. avidin-biotin complex(ABC) 시약을 동시에 준비하며, avidin과 biotin은 실온에서 복합체까지 최소 30분이 필요하므로 이를 준비합니다. 위치
13. 제조업체의 프로토콜에 따라 필요한 양의 ABC 시약을 준비합니다.
14. 0.1M PBS에서 부드러운 교반으로 섹션을 세척합니다(3 x 5분).
15. ABC 시약으로 RT에서 45분 동안 절편을 배양합니다.
16. 0.1M PBS에서 부드러운 교반으로 섹션을 세척합니다(3 x 5분).
17. 디아미노벤지딘(DAB) 작업 용액을 준비하려면 DAB가 발암성 및 기형유발성이므로 DAB와 관련된 모든 단계를 흄 후드에서 수행해야 합니다.
18. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 DAB 용액을 새 플레이트로 옮깁니다.
19. DAB 작업 솔루션이 포함된 플레이트에 섹션을 놓고 섹션에 대한 노출을 최대화하기 위해 손으로 플레이트를 천천히 휘젓습니다.
20. 적절한 신호가 발생할 때까지 현미경에서 DAB 반응을 모니터링합니다(2-5분).
21. 조직을 0.1M PBS(3 x 5분)로 세척하여 원하는 색상 강도로 반응을 중지합니다.
22. 표백제를 사용하여 밤새 흄 후드에 남아 있는 DAB 기질 용액을 비활성화하고 실험실 지침에 따라 폐기하십시오.
23. 젤라틴으로 코팅된 슬라이드의 단면을 PBS에 부유하여 장착합니다. 그런 다음 실온에서 최소 3-4시간 동안 건조시킵니다.
24. 50%, 70%, 95%, 100% 에탄올로 각 섹션을 각각 2분 동안 순차적으로 탈수하고 100% 자일렌에서 5분 동안 투명하게 합니다.
25. 장착 매체를 사용하여 커버슬립하고 배기 후드에 넣어 밤새 건조시킵니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24 well plate	Sigma	CLS3524
100% 에탄올	Fisher Scientific	A406-20	슬라이드 장착 전에 탈수를 위한 에탄올 그라디언트를 만드는 데 사용됩니다.
Xylene	VWR	66004-950	Toxic - 후드 아래에서 사용됩니다. 용도에 따라 매월 자일렌을 교체하십시오.
PBS	Sigma	P3813-10PAK
Triton X-100	Sigma	T-8787
Hydrogen peroxide	Sigma	H1009-100ML
Normal goat serum	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	PBS 5ml의 부피에 시약 A 2방울을 넣고 섞은 다음 시약 B 2방울을 넣고 섞습니다.
과산화 효소 기판	SK-4100
pERK 항체	세포 신호 전달 기술	4370	희석 1:500
비오틴화 염소 항 토끼 IgG 항체<	BA-1000	희석 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	시그마	317616	슬라이드용 장착 매체. 동등한 장착 매체를 사용할 수 있습니다.

< td 스타일 = '너비 : 171pt; '>Vector Laboratories < td 스타일 = '너비 : 311pt; '> 5ml의 이중 증류수 부피에 추가 : 버퍼 스톡 용액 2 방울 및 혼합; DAB 4 방울 및 혼합; 과산화수소 2 방울 및 혼합.td 스타일='너비:171pt;'>Vector Laboratories