Imaging intracellular ATP Dynamics Using FRET-based sensors in an organotypic mouse hippocampal slice(유기형 마우스 해마 절편에서 FRET 기반 센서를 사용한 세포 내 ATP 역학 이미징)

초록

출처: Lerchundi, R., et. al입니다. FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK를 사용한 마우스 뇌의 유기형 조직 절편에서 세포 내 ATP 이미징. J. Vis. Exp. (2019)

이 비디오는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 기반 센서를 사용하여 유기형 마우스 해마 절편에서 세포 내 ATP 수준을 측정하여 생리학적 및 실험적 조건에서 뉴런 및 성상세포의 ATP 역학을 실시간으로 시각화할 수 있도록 하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. FRET 기반 ATP 이미징 (그림 1)

1. 실험 전에 E-ACSF를 준비하고 95% O₂/5% CO₂로 최소 30분 동안 버블링하여 pH 7.4를 얻습니다. 모노크로메이터의 형광등(크세논 램프)을 켭니다(그림 1). 인큐베이터에서 슬라이스를 꺼내기 직전에 관류를 시작하십시오.
   참고: 전체 실험 동안 95% O₂ 및 5% CO₂로 식염수를 거품이 일게 합니다.
2. 연동 펌프를 사용하여 갓 발암된 E-ACSF가 지속적으로 관류되는 실험실로 슬라이스를 옮깁니다(그림 1). 그런 다음 그리드로 슬라이스를 고정합니다. 챔버를 현미경 스테이지에 놓고 관류 시스템을 연결합니다. 관류에는 가스 방지 실험실 튜브가 권장됩니다.
   참고: 실험은 실험 설계에 따라 실온 또는 생리학적 온도에 가깝게 수행할 수 있습니다. 조직의 움직임 및/또는 전단 응력의 변화로 인한 초점 변화를 피하기 위해 관류 흐름의 안정성과 신뢰성을 확인합니다. 당사와 다른 많은 실험실에서 사용하는 슬라이스 작업을 위한 표준 관류 속도는 1.5-2.5mL/분입니다.
3. 투과광을 사용하여 배양된 슬라이스에 초점을 맞춥니다. 실험을 수행할 영역을 식별합니다(예: 해마의 CA1 영역). 이미징 실험을 시작하기 전에 슬라이스가 식염수 조건에 적응할 때까지 최소 15분 동안 기다립니다. 실험 설정의 구성은 그림 1을 참조하십시오.
4. 카메라와 이미징 소프트웨어를 켭니다. 그런 다음 적절한 필터 큐브를 선택합니다.
5. 435/17nm(~435nm)에서 공여체 형광 단백질(eCFP)을 여기시킵니다. 노출 시간을 40ms에서 90ms 사이로 설정합니다.
   참고: 형광등에 슬라이스를 강하게 노출시키면 광독성 효과가 발생할 수 있습니다.
6. 435 nm에서 여기(excitation)는 475 nm(eCFP; 공여체) 및 527 nm(금성, 수용체) 모두에서 방출을 초래합니다. 투광 이미지 스플리터를 사용하여 500nm에서 형광 방출을 분할하고 483/32 및 542/27에서 대역 통과 필터를 사용하여 donor 및 acceptor 형광을 추가로 분리합니다. 강한 발현은 검출기의 포화를 초래할 수 있습니다. 이 경우 중립 밀도 필터를 사용하여 여기 강도를 줄일 수 있습니다.
위치
7. 배경 빼기를 위해 세포 형광이 없는 것으로 보이는 관심 영역(ROI)을 선택합니다. 그런 다음 세포체를 설명하는 ROI를 생성합니다.
8. 이미지 획득 빈도와 전체 녹화 시간을 설정합니다. 장시간(>30분) 실험의 경우 광독성을 방지하기 위해 0.2-0.5Hz의 획득 주파수가 권장됩니다.
9. 녹음을 시작합니다. 제제의 안정성을 보장하기 위해 기준선 조건에서 최소 5분을 기록하는 것이 좋습니다.
   참고: 필요한 경우 녹음 중에 셀의 초점을 조정합니다.

결과

그림 1: FRET 이미징 설정 구성. (A) FRET 이미징 설정에 필요한 다양한 구성 요소와 공간 배열에 대한 개략도. 장치는 광원으로 크세논 램프가 있는 모노크로메이터, 정립 고정 스테이지 현미경(1), 이미지 스플리터 시스템(2), 타임랩스 녹화를 위한 디지털 CCD 또는 CMOS 카메라(3), 안정적인 정수 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-deoxyglucose	Alfa Aesar	L07338	Non-metabolizable glucose analog
밴드 패스 필터 483/32	AHF Analysentechnik AG		Splitter compatible emmittion filter
밴드 패스 필터 542/27	AHF Analysentechnik AG		스플리터 호환 emmision filter
Beamsplitter T 455 LP	AHF Analysentechnik AG		Excitation dichroic mirror
Beamsplitter T 505 LPXR	AHF Analysentechnik AG		Splitter dichroic
데이터 프로세싱 Origin Pro 9.0.0 (64- bit)	OriginLab corporation		Scientific graphing and data analysis software
D-glucose monohydrate	Caelo	2580-1kg
DPBS	GIBCO/Life	14190250	Dulbecco의 인산염 완충 식염수
Eclipse E 600FN upright microscope	Nikon Microscope Solutions
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon Microscope Solutions
Experimental chamber	custom build		live-cell imaging
Hanks' Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H9394	pH 모니터링을 위한 페놀 레드 사용
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma-Aldrich	M7278	Synthetic cell culture media	Monochromator Polychrome V	Thermo Scientific/FEI		ultrafast
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0	Nikon Microscope Solutions		Water Immersion Microscope Objective
NIS Elements 4.50 advanced Research	Nikon Microscope Solutions		이미징 소프트웨어. FRET 이미징
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	<
	Tygon 튜브, 1.52 x 322 mm (Wd : 0.85)
Photoshop CS 6 버전 13.0	Adobe		이미지 처리 소프트웨어
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)	ETH Zürich	v244	인간 시냅신 1 프로모터 단편 hSyn1의 제어하에 ATeam1.03YEMK의 발현을 유도하는 단일 가닥 AAV 벡터.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)	ETH Zürich	v307	인간 신경교섬유산성 단백질 프로모터 단편 ABC1D의 제어하에 ATeam1.03YEMK의 발현을 유도하는 단일 가닥 AAV 벡터.

을 위한 관류 챔버 스위칭 모노크로메이터 업그레이드 버전 td 스타일 = '너비 : 318pt; '> 디지털 CMOS 카메라 < td 스타일 = '높이 : 15.75pt; 너비 : 204pt; '> 관류 튜브 < td 스타일 = '너비 : 119pt; '> Pro Liquid GmbH