마우스 망막의 Two-Photon In Vivo 이미징

초록

출처: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. 특급 (2021).

이 동영상은 이광자 현미경을 사용한 in vivo 망막 이미징 기술을 보여줍니다. 마취된 마우스는 머리를 고정하고, 눈 윤활제를 바르고, 눈 위에 커버슬립을 놓아 이미징을 준비합니다. 형광 단백질을 발현하는 망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 정렬을 위해 상피형광(epifluorescence)을 사용하여 먼저 시각화됩니다. 마지막으로, 이광자 이미징이 사용되어 망막 신경절의 고해상도 시각화가 가능합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 이미지 획득을 위한 마우스 준비

1. 이미징을 위한 마취 마우스
   참고: 이소플루란에 대한 노출을 완화하려면 적절한 폐가스 청소를 보장하십시오. 마취 유도 챔버의 배기 포트가 수동 소기 가스 필터 캐니스터에 연결되어 있고 마우스 마취 노즈피스의 배출구가 가스 배출 장치에서 제공하는 진공 장치가 있는 활성 소기 가스 필터 캐니스터에 연결되어 있는지 확인하십시오. 교체를 위해 필터 캐니스터 무게를 모니터링하기 위한 제조업체의 지침을 따르십시오.
   1. 케타민/자일라진 칵테일을 사용하여 마우스를 마취합니다. 또는 마취 유지를 위해 이소플루란을 사용하는 경우 이소플루란 흡입을 통해 마취를 유도합니다(이미징 세션 > 30분). 소동물 마취 장치를 설정하여 0.5L/min의 유속으로 실내 공기와 혼합된 5% 이소플루란으로 유도실을 채웁니다. 마우스를 유도 챔버에 놓고 마우스가 마취될 때까지 15초 동안 기다립니다.
   2. 이소플루란 기화기를 0%로 전환하고 마취 흐름을 노즈피스로 향하게 합니다. 유도 챔버의 5초 "O₂ 플러시"를 수행합니다. 인덕션 챔버에서 마우스를 꺼내 헤드 홀더에 고정하고 노즈피스를 부착합니다.
   3. 마취 유지를 위해 1% 이소플루란과 실내 공기를 0.5L/min의 유속으로 혼합하여 사용하십시오. 마취 내내 5분 간격으로 호흡수를 모니터링하고, ~60회/분의 호흡수를 유지하기 위해 이소플루란 비율을 조정합니다.
      참고: 이러한 설정(% 이소플루란, 유속)은 케타민/자일라진 칵테일에 의해 유도된 마취 유지에도 사용할 수 있습니다.
2. 동공 확장
   1. 물에 1% w/v 아트로핀과 2.5% w/v 페닐에프린 염산염의 용액을 준비합니다. 확장기 용액을 빛으로부터 보호되는 실온에 보관하십시오.
   2. 일회용 피펫 점안기를 사용하여 이미징할 각 눈에 확장기 용액을 한 방울 떨어뜨립니다. 실내 조명을 끄고 동공이 확장될 때까지 5분 동안 기다립니다. 동공이 확장되면 보푸라기가 없는 조직으로 확장기 용액을 닦아냅니다.
      참고: 확장기 용액이 콧구멍에 들어가지 않도록 하십시오.
   3. 이미징될 각 눈에 윤활제 아이 젤을 크게 한 방울 떨어뜨립니다. 양쪽 눈을 모두 이미징해야 하는 경우, 이미징되지 않은 눈의 아이 젤 위에 작은 플라스틱 접착 필름을 바르면 탈수를 방지할 수 있습니다. 한쪽 눈만 이미징하는 경우 이미징되지 않는 눈에 윤활제 눈 연고를 바르십시오. 위치
3. 이미징용 포지셔닝 마우스
   1. 이미징 헤드 홀더에 마우스를 고정하려면 이어피스 바가 수평 아래 60° 이상의 각도로 기울어질 때까지 헤드 홀더의 메인 암을 돌립니다. 아래쪽 외이도 핀을 안쪽으로 뻗은 위치에 고정하고 위쪽 외이도 핀을 빼낸 위치에 고정합니다.
   2. 마우스가 바이트 바를 향하게 하고 한쪽 귀를 확장된 아래쪽 핀에 장착하고 핀을 외이도에 삽입합니다. 상부 외이도 핀을 고정하는 나사를 풀고 핀을 다른 외이도로 확장합니다. 나사를 조여 머리를 고정합니다.
   3. 바이트 바를 마우스 머리 쪽으로 밉니다. 마우스의 머리를 부드럽게 들어 올린 다음 마우스의 상악 앞니를 바이트 바의 구멍으로 내립니다. 부드러운 힘으로 바이트 바를 집어넣어 마우스 헤드를 고정하고 나사를 조여 바이트 바 위치를 고정합니다.
   4. 이소플루란을 사용하는 경우 마우스의 앞니를 고정하기 전에 슬롯을 통해 노즈피스를 바이트 바에 밀어 넣습니다. 1.3.3단계와 같이 바이트 바 위치를 고정하고 조입니다. 마우스의 코에 꼭 맞을 때까지 윗면에 있는 두 개의 나사를 사용하여 노즈피스를 조이지만 주둥이가 수축되지 않도록 합니다.
   5. 헤드 홀더에 있는 마우스를 현미경으로 옮깁니다.tage 대물렌즈 아래. 눈의 동공이 빛의 경로와 일직선이 될 때까지 헤드 홀더의 메인 암을 회전합니다(그림 1).
   6. 소형 필터 홀더에 #1.5 커버슬립을 놓고 홀더를 현미경 스테이지에 부착합니다. 커버슬립을 눈 쪽으로 내리고 윤활제 아이 젤과 접촉하여 각막 바로 위에 수평으로 놓이도록 합니다(그림 1). 커버슬립이 각막에 닿지 않도록 하십시오.
      참고: 현미경에서 여기광 경로가 epifluorescence로 설정되어 있고 방출광 경로가 접안렌즈로 설정되어 있는지 확인하십시오. 가장 낮은 전력으로 에피 형광 조명을 켜고 조명 셔터를 엽니다. 이미징되는 형광단에 해당하는 epifluorescence illuminator 파장과 형광 필터를 선택합니다.
   7. 스테이지를 XY 차원으로 기동하고 스테이지 제어 및 전동 포커스 드라이브를 사용하여 Z 위치에서 광시야 여기광이 각막을 완전히 덮을 때까지 대물렌즈를 조종합니다. 접안렌즈를 통해 보면서 s의 Z-위치를 계속 조정합니다.tage 망막의 형광 세포나 구조에 초점이 맞춰질 때까지. 샘플 신호가 접안렌즈를 통해 관심 있는 개별 세포 또는 구조를 분해하기에 충분히 밝기 않은 경우 epifluorescence illuminator 출력을 높입니다.
      참고: 망막을 찾는 데 문제가 있는 경우, 홍채는 고정한 다음 망막 쪽으로 초점을 맞출 수 있는 고대비 랜드마크입니다. 이 단계를 통해 동공이 최대로 확장되었는지 확인할 수도 있습니다.
   8. 마우스 렌즈로 축의 이미징 영역을 얻습니다. 초점면을 조정할 때 초점이 맞지 않는 빛의 팽창 또는 수축만 발생할 때까지 헤드 홀더의 다양한 자유도를 사용하여 마우스의 각도를 조정합니다. 에피형광 조명을 끄고 조명 셔터를 닫습니다.
      참고: Z 방향 초점면을 스크롤하는 동안 초점이 맞지 않는 빛의 상당한 X-Y 시차는 망막이 이미징 광 경로에 대해 축에 있지 않음을 나타냅니다.

2. 이광자 이미지 획득

1. 이미지 설정 및 획득 매개변수
   참고: 실내 조명을 끄고 실내 미광원을 가립니다. 에피형광 조명이 꺼져 있고 조명 셔터가 닫혀 있는지 확인하십시오.
   1. 여기광 경로를 레이저로 전환하고 방출광 경로를 광전자 증배관(PMT)으로 전환합니다.
   2. 이미지 획득 소프트웨어에서 프레임 크기를 512 x 512로 설정하고 프레임 평균을 3으로 설정합니다. 슬라이스당 단계를 -8μm로 설정합니다. z-stepping이 스택의 맨 위에서 시작하여 아래쪽으로 진행되도록 지정하여 광수용체의 이광자 레이저 활성화를 최소화합니다.
      참고: 이미징 시간을 늘리는 대신 Z 해상도를 높이기 위해 단계 크기를 줄일 수 있지만, 이 이미징 구성에서 세포 소마타를 분리하는 데 8μm 단계만 충분합니다.
   3. PMT를 켜고 활성화합니다. PMT 전압을 680V로 조정하고 여자 셔터를 활성화합니다.
      참고: 전원이 공급되는 PMT는 빛 손상에 취약합니다. 에피형광 조명기가 꺼져 있고, 현미경 인클로저 커튼이 당겨져 있으며, 실내 조명이 꺼져 있는지 확인합니다.
   4. 1% 레이저 출력으로 시작하여 대상 조직의 실시간 이미지 미리보기를 시작합니다. 디스플레이 밝기를 자동으로 조정하여 관심 있는 셀 또는 구조를 시각화합니다. 스캔 단계를 자동으로 조정합니다. 대상 조직이 어둡거나 불분명한 경우 2.4.4단계에서 설정한 한계(45mW)를 초과하지 않고 구조가 보일 때까지 레이저 출력 백분율을 높입니다.
      참고: 16비트 이미지의 경우 관심 구조를 포함하는 Z-평면에서 밝기를 자동 조정할 때 표시 값이 ~1000이면 샘플의 밝기가 충분함을 나타냅니다.
   5. 현미경 스테이지를 X-Y 방향으로 움직여 원하는 이미징 영역의 중심을 잡은 다음, 관심 있는 구조에 초점이 맞춰진 Z-평면으로 이동합니다.
      참고: 시신경두에 인접한 이미징은 만성 이미징 실험을 위한 명확한 랜드마크 역할을 할 수 있습니다.
   6. 이것이 만성적인 타임랩스 실험인 경우, 획득 컴퓨터에서 이전 이미지를 열고 동일한 관심 영역을 찾기 위한 참조로 사용하십시오. 이미징 각도가 이전 이미지와 유사하여 최소한의 시차로 동일한 세포 세트를 획득하도록 합니다.
      참고: 이전 시점(그림 2)과 동일한 셀을 이미지화하려면 마우스 헤드 위치를 추가로 조정해야 할 수 있습니다.
   7. 관심 있는 가장 위쪽 및 가장 아래쪽 Z 평면으로 이동하여 이미징 스택의 Z 제한을 설정하고 이미지를 획득합니다. 이미지 획득이 완료되면 PMT와 투광 셔터를 비활성화합니다. 방출광 경로를 다시 접안렌즈로 전환하고 여기광 경로를 에피형광 조명으로 전환합니다. 현미경에서 마우스를 제거하십시오.tage.

결과

그림 1: 생체 내 이미징을 위한 마우스 포지셔닝. 광 경로를 가진 축에 동공이 있는 마우스를 배치하기 위해 마취된 마우스는 먼저 헤드 홀더에 구속되고 헤드는 회전 및 각도를 이루며 윤활제 아이 젤의 큰 방울을 눈에 놓고 마우스를 스테이지에 놓습니다. 커버슬립은 광 경로에 수직인 커버슬립 홀더에 장착되고 눈을 향해 내려갑니다. 커버슬립은 각막이나 마우스 머리(왼쪽)에 닿지 않아야 하며, 이는 커버슬립이 편향되면 분명합니다. 그러나 커버슬립은 비말(오른쪽)의 허리 둘레를 피할 수 있을 만큼 충분히 가까워야 하는데, 이는 샘플에 대한 확대 감소 효과를 갖기 때문입니다. 젤 침지를 적용하고 커버슬립을 고정한 후 스테이지는 현미...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
#1.5 coverslip	ThermoFisher	152440	Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm
50 mL 유리 주사기	Hamilton	80950	22G 시멘트 바늘
마취 공기 펌프	RWD Life Science	R510-30
Atropine	Sigma	A0132	동공 확장기 용액
Basic Small Animal Anesthesia Device	RWD Life Science	R500IE
붕규산 유리 모세관	Sutter	B150-86-10	외경 1.50mm, 내경 0.86mm, 길이 10cm
CFP/YFP 필터 큐브	Chroma	사용자 정의	480/40, 505 롱 패스, 535/30
ChromoFlex - 2채널 PMT 검출 장치	Scientifica	S-MPLG-1002
순환 가열 펌프	Braintree Scientific	tp-700	37°C
집착 필름	VWR	10713-916
컴팩트 필터 홀더	ThorLabs	DH1	마우스 눈
Cx3cr1-GFP 형질 전환 마우스 (B6.129P2 (Cg) -Cx3cr1tm1Litt / J)	잭슨 연구소	5582
DAQ 컨트롤러 섀시	National Instruments	PXIe-1073
데이터 수집 디바이스	National Instruments	BNC-2090A
디지타이저가 있는 FPGA 모듈	National Instruments	NI-5734
가스 배출 장치	RWD 생명 과학	R546W
GenTeal Severe 윤활제 아이 젤	Alcon	(현지 약국에서)	이미징
GFP / 레드 필터 큐브	크로마	사용자 정의	535/30, 560 롱 패스, 605 / 70
가열 패드	McKesson 의료 및 외과	190147
Pockels Cell	Scientifica	S-MP-101080과 함께 사용하기위한 HyperScope Launch Optics
HyperScope 메인 모듈	Scientifica	S-MP-100466
HyperScope Scan Path	Scientifica	S-MP-100406
HyperScope X galvo module	Scientifica	MP-100443
ImageJ 피지 소프트웨어		프리웨어
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-06
Isoflurane 가스 필터 캐니스터(활성 소기)	RWD Life Science	R510-31
Isoflurane 가스 필터 캐니스터(수동 소기)	RWD Life Science	R510-31S
케타민 HCl (100 mg/mL)	Vedco	NDC 50989-161-06
M32 to M26 adapter	ThorLabs	M32M26S <
Spectra-Physics	NA
MATLAB software	MathWorks	NA	R2015b
meloxicam (5 mg/mL)	Boehringer Ingelheim	NDC 0010-6013-01	진통제
Micorscope Objective	Edmund Optics	46-404	Mitutoyo WE715042319
micropipette puller	Sutter	Flaming/Brown Model P-97
미네랄 오일	Fisher	BP2629-1
Mini bulldog 지혈 클램프	Fine Science Tools	18053-28
소형 EVA 튜빙 0.02" ID, 0.06" OD	McMaster Carr	1883T1
Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD	McMaster Carr	1883T4
마우스 헤드 홀더	Narishige	SGM-4
번호 5 집게	파인 사이언스 도구	11251-10
광학 포스트 1/2 "	ThorLabs	TR3-P5
광 파워 미터 키트	ThorLabs	PM100D
pE-300 울트라 LLG Deivery	Scientifica	COO-LED3ULLGs
페닐 에프린 하이드로 클로	시그마	P6126	동공 확장기 용액
Conoptics	350-80-02
Pockels 셀 증폭기	Conoptics	모델 302RM
프로파라카인 하이드로 클로	시그마	1571001	눈 고정을
Red & Far Red 단거리 통과 필터 Cube	Chroma	사용자 정의	560 짧은 통과
회전 1/2" 포스트 클램프	ThorLabs	SWC
ScanImage 패키지	Vidrio Technologies	Freeware	이미지 획득 소프트웨어; 버전 5.4.0(2018); requires MATLAB
sodium chloride solution, sterile (0.9%)	Fresenius Kabi	NDC 63323-186-01
Stereomicroscope	Leica	S9 E
탁상용 원심분리기	Oxford	Benchmate C8
Terramycin oxytetracycline/polymyxin B 항생제 안과 연고	Zoetisus	NA	유리체강내 주사
ThermoRack 냉각 시스템	솔리드 스테이트 냉각 시스템	ThermoRack 401	20 °C
	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee
Vgat-Cre 형질전환 마우스 (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)	잭슨 연구소	16962
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VivoScope for In Vivo Imaging Scientifica		S-MPVS-1200-00P
White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment	Stye	NA	For 이미징 후 사용
xylazine HCl (20 mg/mL)Akorn NDC 59399-110-20

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