두개골 임플란트를 사용한 신경 면역 역학의 형광 이미징

초록

출처: Bisht, K., et al. 생쥐의 신경 면역 역학에 대한 반복적인 생체 내 이미징을 수행하기 위한 정밀한 뇌 매핑. J. Vis. Exp. (2020)

이 비디오는 두개골 임플란트가 있는 형질전환 마우스의 신경 면역 역학의 형광 이미징을 보여줍니다. 혈관 및 신경 안정성은 신경 활동에 대한 면역 반응을 반영하는 동적 미세아교세포 변화와 함께 이미지화됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 두개골 창 이식을 위한 마우스 준비

참고: 형광 태그가 있는 다양한 형질전환 마우스 라인이 이미징에 적합합니다.

1. CX3CR1GFP/+ 마우스를 사용하여 in vivo에서 미세아교세포를 시각화합니다. 일반적으로 무게가 17-25g인 4주에서 10주 된 어린 쥐에서 어린 성인용 마우스가 사용됩니다.
   참고: 이 방법은 젖을 떼기 전의 쥐에게도 적합하지만, 어미가 수술 후 새끼를 적절하게 돌보지 않으면 먹이를 주기 위해 쥐를 어미와 함께 우리로 되돌려 보내야 하기 때문에 회복이 복잡해질 수 있습니다. 따라서 젖을 뗀 후 마우스를 사용하는 것이 좋습니다.
2. 마취실에서 이소플루란(isoflurane, 5분 동안 산소 주입을 위해 1% 흐름)을 사용하여 마우스를 마취합니다. 마우스가 발가락 및/또는 꼬리 꼬집기에 대한 움직임이나 경련 반응을 보이지 않는지 확인하십시오. 챔버에서 마우스를 꺼내 야외에서 헤어 트리머를 사용하여 눈높이에서 목 부위 위쪽까지 귀 사이의 머리털을 철저히 면도합니다.
   참고: 사용되는 이소플루란의 농도는 유도 챔버의 크기에 따라 다릅니다. 따라서 작은 챔버의 경우 3-4%의 이소플루란을 사용하여 효과적으로 마취를 유도할 수 있는 반면 큰 챔버에는 최대 5%가 필요합니다.
3. 마취를 위해 마우스를 정위 수술 스테이션 노즈콘으로 이동하고(수술 중 유지 관리를 위해 1.5-2%), 이어바를 사용하여 머리를 안정시키고, 체온을 따뜻하게 유지하기 위해 마우스를 가열 패드에 유지합니다.
4. 눈 연고로 양쪽 눈을 윤활합니다. 절개 부위에 100μL의 0.25% 부피바카인(마우스에 8-12시간 동안 국소 진통제를 제공하기 위해)과 100μL의 4mg/mL 덱사메타손(수술 절차로 인해 발생할 수 있는 염증을 줄이기 위해)을 피하로 주입합니다. 다음 단계로 이동하기 전에 마우스를 최소 5분 동안 그대로 두십시오.
5. 면도한 머리는 베타딘과 70% 알코올을 번갈아 가며 3개씩 번갈아 가며 닦습니다. 수술용 칼날이나 가위를 사용하여 귀 사이의 두개골 뒤쪽에서 눈 사이의 전두부까지 두피의 정중선을 절개합니다. 나머지 피부는 두개골이 드러나도록 절단합니다.
6. 두피와 두개골 사이에 위치한 결합 조직을 과산화수소 3% (H₂O₂)로 세척하고 정위 좌표로 이미지화할 뇌 영역을 국소화합니다.
   위치 참고: 두개골 표면의 절개 부위에서 종종 약간의 출혈(1.5단계)이 있습니다. 이 출혈은 일반적으로 3-5분 이내에 저절로 해결됩니다. 과산화물로 청소하는 것이 도움이 됩니다. 이전의 부피바카인 치료(1.4단계)도 이 기간 동안 출혈량을 제한하는 것으로 나타났습니다.

2. 마우스 두개골 창 이식 수술

1. 치과용 드릴 비트(팁 직경 0.7mm)를 사용하여 두개골에 ~4mm의 원형 구멍을 뚫고 뾰족한 집게를 사용하여 두개골의 이 부분을 조심스럽게 제거합니다. 6-8주 된 마우스의 체감각 피질을 이미징하려면 개두술의 중심을 -2.5 후방에, 2.0 측면에 브레그마± 배치합니다. 드릴링하는 동안 멸균 식염수와 면봉으로 두개골을 정기적으로 적셔 뇌를 식히고 뼈 파편을 청소하며 두개골 뼈를 부드럽게 만들어 최종적으로 제거합니다.
   참고: 개두술의 좌표는 관심 지역과 생쥐의 나이에 따라 달라집니다.
2. 두개골을 제거한 후 식염수를 적신 작은 덮개 유리(0.1 ± 0.02mm 두께의 #0 크기)를 개두술에 조심스럽게 놓습니다. 멸균 물티슈를 사용하여 과도한 식염수를 말리십시오.
3. 뾰족한 어플리케이터(예: 피펫 끝 또는 깨진 나무 면봉의 뾰족한 끝)를 사용하여 창문 주위에 시아노아크릴레이트 접착제를 바르고 뇌와 두개골에 부착되도록 합니다. 프라이머 접착제를 두개골의 나머지 부분에 바르고 20-40초 동안 경화광으로 경화시킵니다. 최종 접착제로 창 주위에 우물을 준비하고 20-40 초 경화 광으로 경화하십시오.
4. 개두술의 반대쪽 반구에 있는 두개골에 작은 헤드 플레이트를 붙이고, 먼저 프라이머 접착제를 프라이머로 사용한 다음 최종 접착제로 붙입니다. 경화광으로 각각 20-40초 동안 경화하십시오.
   참고: 이 절차 중에 두개골이 접착제로 덮여 있으면 봉합사가 필요하지 않습니다.

3. 수술 후 관리

1. 마취 없이 생쥐가 깨어나게 하고(온열 패드에서 회복하면 회복 시간이 단축됨) 완전히 깨어나면 집 케이지로 되돌립니다. 수술 후 진통제로 부프레노르핀 SR(0.5mg/kg)을 피하주사 72시간 동안 복용할 수 있습니다.
2. 수술 후 건강한 회복을 위해 마우스에게 물에 담근 일반 고체 차우와 같은 매우 부드러운 음식이나 젤 형태의 음식을 제공합니다.
   참고: 수술 직후 부드러운 음식을 1회에 한 번만 섭취하는 것으로 충분합니다.
3. 수술 절차의 처음 72시간 동안 건강과 적절한 회복을 위해 매일 마우스를 모니터링하십시오. 그 후, 창문 이식 수술에서 영상은 빠르면 2주에 시행됩니다.
   참고: 잘 수행되면 생쥐는 정상적인 보행 행동, 충분한 케이지 탐색, 좋은 수분 공급, 안정적인 체중 증가, 케이지 내의 다른 마우스 및 케이지 내의 다른 개체와의 광범위한 상호 작용을 보여 잘 회복합니다. 수술 후 무기력, 탈수 및 10% 이상의 체중 감소를 보이는 마우스는 안락사되고 연구에서 제외됩니다.

4. 초기 이미징을 위한 이광자 뇌 매핑

1. 마우스 마취(이소플루란, 5% 유도 및 1.5% 유지). 35°C의 가열판에서 유지되는 이광자 현미경 스테이지에 헤드플레이트를 장착하기 위해 나사를 사용하여 헤드를 안정화합니다. Rhodamine B(2mg/mL)와 같은 혈관 염료 100μL를 복강내로 주입합니다.
   참고: 이미징은 마취 없이 깨어 있는 쥐에서도 수행할 수 있습니다. 그러나 최근 연구에 따르면 마취는 미세아교세포 감시 역학에 영향을 미친다고 합니다. 깨어 있는 마우스에서 이광자 이미징을 위한 머리 고정은 최소 25일 동안 만성 이미징 중에도 스트레스를 증가시킵니다.
2. 70% 에탄올을 적신 면봉을 사용하여 두개골 창의 표면을 부드럽게 청소합니다. 두개골 창에 물이나 식염수를 몇 방울 떨어뜨리고 대물렌즈가 침지 렌즈이므로 대물렌즈를 용액 안으로 내립니다.
3. 실험실 노트에 주요 혈관 랜드마크를 표시하는 대략적인 지도를 손으로 그리면서 접안렌즈를 통해 환형광으로 바라봅니다. 이 그림을 사용하여 이광자 이미징 중 특정 영역을 식별할 수 있습니다. 또는 현미경에 장착된 카메라나 휴대용 카메라 또는 전화기를 통해 혈관 사진을 찍습니다.
   참고: 이 손으로 그린 이미지와 그림은 두 개의 광자 이미징 전에 현미경으로 동일한 넓은 영역을 다시 방문하는 것을 용이하게 하기 위한 것입니다. 이는 정확한 이미지 매핑이 아닙니다.
4. 두 개의 광자 이미징에서 필요에 따라 형광 세포와 혈관의 이미지를 수집합니다. 후속 이미징을 위해 정확한 영역을 다시 방문할 수 있도록 적절한 좌표를 주의 깊게 기록하십시오. 이 초기 이미징 세션에서 여러 시야를 수집합니다(예: 조직 부피를 통해 1-2μm마다 z-stack 이미지 획득).
   참고: 두 개의 광자로 이미지를 수집하는 동안, 혈관 랜드마크는 거친 매핑에 사용됩니다. 미세 매핑이 필요한 경우 Thy1-YFP 마우스의 YFP 표지 수상돌기가 사용됩니다.
   1. 이미징을 위해 다음과 같은 권장 매개변수를 사용하십시오: 880-900nm의 파장이 최적입니다. GFP 및/또는 dsRed / Rhodamine excitation의 경우 525/50nm(녹색 채널) 및 620/60nm(빨간색 채널) 방출 필터가 있는 565nm 이색성 미러가 사용됩니다. GFP 및 YFP 분리를 위해 500/15 및 537/26 nm 방출 필터가 있는 509 nm 이색성 미러가 사용됩니다. 뇌의 전력은 25mW 이하로 유지됩니다. 이미지 해상도는 1024 x 1024 픽셀이며, 1.5X 줌 비율에서 25X 0.9 NA 대물렌즈로 촬영한 시야는 295.24 x 295.24 μm입니다.
5. 이미징이 끝나면 마우스를 무대에서 내리고 마취에서 깨어나 향후 이미징 세션이 있을 때까지 홈 케이지로 돌아갑니다.

5. 이광자 이미징 및 재이미징

1. 초기 이미징 세션 후 몇 시간에서 몇 달이 걸릴 수 있는 향후 후속 이미징 세션을 위해 마우스를 마취하고(Isoflurane, 5% 유도 및 1.5% 유지), 이광자 현미경에 장착하고 가열판에 유지한 다음 Rhodamine B(2mg/mL)와 같은 혈관 염료 100μl를 다시 주입합니다.
2. ImageJ에서 이전에 얻은 이미지를 열고 이러한 이미지와 이전 세션의 메모를 사용하여 이전에 이미지화된 영역을 식별하고 조심스럽게 다시 이미지화합니다.
3. 이미징 창이 명확하거나 연구 범위에 필수적인 한 이 작업을 반복합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Coverglass (3mm)	Warner Instruments	64-0726
시아노아크릴레이트 접착제 (Krazy Glue)	Amazon	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED 경화 라이트 시스템	Dental Health Products, Inc	910860-1
Dental Drill	Osada: www.osadausa.edu	EXL-M40
드릴 비트	Fine Science Tools	#19008-07
Eye Ointment	Henry Schien	1338333
iBond Total Etch (Primer glue)	Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)	66040094
Rhodamine B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Final glue)	Top Dent (Ivoclar Vivadent)	#595956
Wahl Brav Mini+	Amazon	https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1