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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토위원회에서 검토 및 승인되었습니다.
1. 형질전환 생쥐의 횡격막과 횡격막 신경의 준비
- 이 마우스의 유전자형을 분석하기 위해 형질전환 마우스와 올리고뉴클레오티드 프라이머를 구입하십시오.
- 적절한 형질전환/넉인 Cre-driver 대립유전자 사본 1개와 조건부 GCaMP3/6 대립유전자 사본 0개를 발현하는 3-6개월 된 마우스를 조건부 GCaMP3/6 대립유전자 사본 1개 또는 2개와 Cre-driver 대립유전자 사본 0개를 발현하는 동일한 연령의 두 번째 마우스와 번식시킵니다.
- 새끼를 유전자형으로 분류하고 Cre 및 조건부 GCaMP3/6 대립유전자로 표시하십시오. 이들은 이후 이중 형질전환 마우스(예: Myf5-Cre, 조건부 GCaMP3)라고 불립니다.
참고: 이러한 방식으로 모든 데이터는 Cre 및 조건부 GCaMP3/6 대립유전자 모두의 사본 하나를 발현하는 마우스에서 파생됩니다. 이것은 이러한 교배에 다른 돌연변이 마우스(예: 녹아웃)를 추가할 때 특히 중요합니다.
- 이중 형질전환 마우스가 적절한 연령(예: 출생 후 0일 또는 5일[P0 또는 P5] 또는 성체)인 경우, 가위로 마우스의 목을 베거나(P10 미만 마우스의 경우) 이소플루란 흡입실에 넣어 안락사시킵니다. 한 쌍의 집게로 꼬리를 꼬집는 것에 더 이상 반응하지 않을 때, 그들은 희생 할 준비가되어 있습니다.
- 가위로 동물의 목을 베어 제물로 바치십시오.
- 홍채 절제술 가위로 동물 전체를 가로질러 간 바로 아래, 심장과 폐 바로 위를 가로로 절개합니다.
- 간, 심장 및 폐를 절개하면서 흡입 전극으로 끌어당길 수 있을 만큼 충분히 긴 횡격막 신경의 길이(즉, 1 - 2cm)를 유지하도록 주의하십시오.
참고: 좌측 횡격막 신경은 좌측 횡격막의 내측 부분으로 들어가는 흰색 조직 조각으로 식별될 수 있습니다. 폐를 제거할 때 절단해서는 안 됩니다. 우측 횡격막 신경은 상대정맥(superior vena cava)을 포함하고 있는 근막(fascia) 조각 내에서 운영되며 대정맥(vena cava)보다 얇고 하얗습니다. 이 둘은 함께 우측 내측 횡격막을 관통합니다. - 횡격막 주위의 얇은 융기를 제외하고 흉곽과 척추를 추가로 제거합니다.
- 다이어프램과 횡격막 신경 샘플을 어둠 속에서 10분 동안 1μg/mL 594-αBTX의 Krebs-Ringer 용액이 있는 마이크로분리 튜브에 넣습니다.
참고: 이 농도의 594-αBTX는 아세틸콜린 수용체(AChR)의 기능을 차단하지 않고 표지합니다(개인 관찰).
2. 근육 활동 전위의 자극 및 기록
- 미세한 핀을 사용하여 실리콘 유전체 젤로 코팅되고 ~8mL의 산소가 공급된 Krebs-Ringer 용액으로 채워진 6cm 접시에 다이어프램을 고정하고 현미경 스테이지에 놓습니다. 30분 동안 더 많은 Krebs-Ringer 용액(8mL/분)을 다이어프램에 관류합니다.
참고: 이것은 결합되지 않은 594-αBTX를 헹구고 해부 후 조직을 평형화합니다. - 정해진 방법에 따라 흡입 전극을 만드십시오.
- 4X 배율에서 미세 조작기를 사용하여 흡입 전극을 왼쪽 횡격막 신경 위로 이동하고 흡입 전극에 부착된 튜브에 연결된 5mL 주사기의 배럴을 당겨 흡입을 적용합니다.
참고: 흡입 전극에 성공적으로 흡입되면 횡격막 신경이 팽팽해집니다. 자극기를 켜고 수동 스위치를 1번 돌려 횡격막 신경을 자극합니다. - 명시야 조명으로 육안으로 검사하여 1Hz 자극에 반응하여 다이어프램이 수축하는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 볼륨을 조정하십시오.tage 노브를 점진적으로 돌려 근육 수축을 육안으로 검사하여 확인할 수 있는 초최대 펄스를 달성하십시오. 그래도 보이지 않으면 주사기로 신경을 불어내고 흡입을 하여 다시 흡입해 보십시오.
- 관류를 끄고 근육 특이적 미오신 억제제인 BHC6 또는 전압 개폐 나트륨 채널 길항제인 μ-코노톡신8을 최종 농도 100μM까지 첨가합니다.
- 100μM BHC를 만들려면 DMSO에 200mM 스톡 4μL를 피펫팅하고 1mL의 Krebs-Ringer 용액에 미리 희석합니다.
- 접시에서 Krebs-Ringer 용액 1mL를 제거합니다.
- 미리 희석한 BHC를 접시에 넣습니다.
참고: 이 사전 희석은 GCaMP3 발현 세포에서 비일시적 형광 반응의 희석되지 않은 DMSO에 의한 유도를 방지하는 데 도움이 됩니다. - 30분 정도 기다린 후 20-30분 동안 새로운 Krebs-Ringer 용액의 관류를 켭니다.
- 녹음 전극을 준비합니다.
- 장갑을 끼고 외경(OD)이 1mm이고 내경(ID)이 0.4mm인 붕규산 필라멘트 유리를 마이크로피펫 풀러에 넣고 다이얼을 조여 제자리에 고정한 다음 풀러 도어를 닫습니다.
- P-97 풀러를 사용하여 열 900, 당기기 120, 속도 75, 시간 250, 압력 500 및 추가 루프 없음 설정을 프로그래밍합니다.
참고: 저항(R)은 증폭기의 소프트웨어 제어를 사용하여 측정되며, 데이터 수집 소프트웨어는 공식 V = IR을 풀어 저항을 확인합니다. 소프트웨어 컨트롤러는 전극을 통해 알려진 전류(I)(일반적으로 1nA)를 전달하고 전압(V)의 변화를 측정하여 R을 풀 수 있습니다. - 배아 다이어프램의 경우 저항이 60MΩ에 가까운지 확인하고 구형 다이어프램의 경우 10 - 20MΩ에 가까운지 확인하십시오. 기록 전극에 3M 염화포사튬(KCl)을 로드합니다.
- 10X 배율에서 스테이지 반대편에 있는 두 번째 마이크로 매니퓰레이터를 자극 전극으로 사용하여 전극을 근육 쪽으로 내립니다.
- 전기생리학적 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 휴지 멤브레인 전위가 0에서 -65mV 이하로 변경될 때까지 기다립니다.
- 1Hz에서 자극하고 적당한 오버슈트(-65mV 이하에서 시작할 때 0mV 이상으로 상승하는 전위)를 보이는 큰 전위를 확인하여 근육 활동 전위의 존재를 확인합니다. 자극 아티팩트와 활동 전위를 혼동하지 마십시오.
참고: 잠재력은 자극 아티팩트보다 지속 시간(~5ms)이 훨씬 깁니다.
3. 샘플의 형광 이미징
- 20X 배율에서 녹색/황색광 여기(550nm)에서 594-αBTX 표지된 신경근 접합부 또는 NMJ를 찾아 근육 중앙에서 종판 밴드를 찾습니다. 블루 라이트 여기(470nm)로 전환하여 이미지를 만듭니다. Ca2+ 반응, 운동 뉴런 또는 슈반 세포.
- 원하는 경우 이중 파장 이미징을 위해 대역 통과 필터와 이색성 단일 가장자리 필터로 이미지 스플리터를 설정합니다.
- GCaMP3/6 발현 조직에서 나타나는 최대 형광(Fmax)을 계산하려면 다이어프램 제제에 12μL의 3M 염화칼륨(KCl)을 첨가합니다.
- GCaMP3/6 발현 조직이 KCl에 대한 응답으로 binning 없이 20X 배율에서 포화를 나타내는 수준의 110%로 설정된 룩업 테이블 표시줄의 밝기 표시줄로 실험을 수행합니다.
- 빠른 이벤트를 놓치지 않도록 초당 20프레임으로 녹화합니다.
- 흡입 전극을 사용하여 일련의 충격을 전달하여 20 - 40Hz의 1 - 45초로 신경 자극을 자극하거나 목욕 응용 프로그램 또는 관류에 의해 약리학적 작용제를 추가하고 동적 형광 Ca2+ 응답.
참고: NMJ에서 조직 특이적 적색 또는 원적외선 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI) 또는 유전자 인코딩 전압 지표(GEVI) 마우스를 사용할 수 있게 되면 NMJ에서 두 개의 별개의 세포 요소를 반영하는 두 개의 동적 신호를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. - 원하는 결과를 얻어 이미징 또는 전기생리학적 실험이 완료되면 관류 라인을 통해 물을 관류하고 흡입 전극을 통해 물을 2배 - 3배 빨아들여 염분이 축적되지 않도록 합니다.